Toxoplasma gondii

I parassiti devono impegnare le proprie forze per completare il ciclo biologico a scapito di ospiti che mettono in pratica una serie di auto-difese. Il meccanismo è importante soprattutto per quei parassiti nel cui ciclo c’è un ospite vettore che è in stretto contatto con – o viene mangiato da – un organismo bersaglio specifico in cui il parassita continua il ciclo. Il parassita ed il suo ospite si devono trovare nel posto giusto al momento giusto affinché avvenga la trasmissione al successivo ospite idoneo. Questo, in alcune situazioni, ha portato la selezione naturale a favorire i parassiti in grado di manipolare il comportamento dei propri ospiti.

I parassiti possono utilizzare sostanze chimiche od altri mezzi per alterare i comportamenti degli ospiti in modo da trarne benefici, aumentando le possibilità di trasmissione all’ospite successivo. Possono verificarsi dei cambiamenti nel fenotipo dell’ospite, come l’acquisizione di nuovi comportamenti, che forniscono una forte evidenza del concetto di fenotipo esteso, cioè di geni di un organismo che hanno un’espressione fenotipica in un altro organismo.

Esempi classici di “manipolazione” parassitaria

La letteratura scientifica presenta molti casi di comportamenti modificati degli animali parassitati. Gli spinarelli (piccoli pesci) che ospitano la forma larvale del cestode Schistocephalus solidus, nuotano più vicini alla superficie dell’acqua e sono meno impauriti dalla presenza degli uccelli predatori che fungono da ospiti definitivi (OD). I roditori infestati dal nematode Trichinella spiralis o dal protozoo Sarcocystis cernae manifestano comportamenti d’allerta meno pronunciati nei confronti dei predatori, facilitando la trasmissione del parassita agli OD.

In alcuni casi si osservano comportamenti completamente nuovi negli ospiti infestati. Per esempio, un ragno tessitore infestato dalla larva di una vespa parassita, costruisce una ragnatela diversa dal solito per proteggere la larva emergente dopo la morte del ragno stesso. Un’altra vespa parassita induce il suo ospite, un bruco, a restare vicino al parassita dopo che lo stesso è emerso dal suo corpo, proteggendo le pupe da potenziali predatori, agendo come una sorta di guardia del corpo. Le formiche infestate da un nematode che deve essere trasmesso ad uccelli frugivori, non solo diventano simili a frutti sviluppando un addome rigonfio e rossastro, ma si comportano anche come frutti, rimanendo appesi tra gli altri frutti di colore simile, con l’addome in posizione rialzata ed immobile, in attesa degli uccelli predatori. Le larve di alcuni nematodi mermitidi sono parassite e si sviluppano in ospiti artropodi, ma devono raggiungere l’ambiente acquatico in cui i vermi adulti vivono dopo la maturazione. Inducono il loro ospite artropode a suicidarsi portandolo a cercare l’acqua ed a tuffarcisi. Anche in questo caso la manipolazione coinvolge l’improvvisa comparsa di nuovi comportamenti dell’ospite indotti dal parassita a proprio vantaggio.

È evidente che molti parassiti sono in grado di manipolare il comportamento del loro ospite in natura. Ed anche gli animali domestici possono essere infestati da parassiti manipolatori sia come ospiti bersaglio che come vettori manipolati. La rabbia è uno degli esempi migliori di un patogeno che altera il comportamento dell’ospite. Il Rhabdovirus infetta il SNC dei mammiferi (in particolare le regioni del cervello che controllano i comportamenti sociali e di aggressività) e le ghiandole salivari. L’ospite infetto può manifestare aggressività che facilita la trasmissione del virus attraverso il morso. Anche se l’esito fatale della rabbia costringe l’agente patogeno a cercare continuamente nuovi ospiti, i cambiamenti comportamentali indotti dal virus assicurano la trasmissione, la sopravvivenza e la diffusione del patogeno nel tempo, nello spazio e tra specie con un’efficienza davvero straordinaria.

Parassiti di interesse veterinario

Dicrocoelium dendriticum

Dicrocoelium dendriticum

Il trematode D. dentriticum (due ospiti intermedi [OI] ed un OD) ha una diffusione mondiale (Europa, Asia, Nord Africa ed America). Anche se la patogenicitià generalmente è bassa, la dicroceliosi può portare a dimagrimento e riduzione della produzione di latte nei ruminanti domestici (OD) e, talvolta, può essere mortale. Attualmente stanno aumentando le segnalazioni della malattia, soprattutto a causa dello sviluppo di resistenza nei confronti degli antielmintici ed a causa della diffusione del parassita stesso. D. dendriticum è trasmesso ai ruminanti, comprese vacche e pecore domestiche, quando si cibano accidentalemente di formiche parassitate (dalle metacercarie) attaccate alle erbe. Le larve del parassita inducono i loro insetti ospiti a salire in cima agli steli d’erba ed a restarci ancorati tramite le mandibole (in cui inducono una paralisi spastica, dovuta al fatto che 1-2 metacercarie, invece d’incistarsi, restano avvolte da una membrana idrofila sensibile alle variazioni di luce e temperatura, in prossimità del ganglio nervoso retrofaringeo; nelle ore più fresche della giornata la membrana si dilata e comprime il centro nervoso), in attesa dell’ingestione da parte di un erbivoro al pascolo.

Diplostomum spathaceum

Cataratta da Diplostomum spathaceum

Il comune verme piatto (trematode) oculare D. spathaceum ha un ciclo biologico a 3 ospiti che comprendono lumache limneidi, pesci ed uccelli che si cibano di pesci, come i cormorani. Le cercarie che nuotano liberamente, prodotte tramite moltiplicazione asessuata nella lumaca e liberate nell’acqua, devono trovare un pesce in cui penetrare attraverso le branchie o la pelle. Migrano nei tessuti fino al cristallino dell’occhio in cui si sviluppano in metacercarie. Il ciclo viene completato quando il pesce ospite viene mangiato, insieme alle metacercarie, dall’ospite definitivo (uccello). Localizzandosi negli occhi dell’ospite, le metacercarie causano la cataratta per via della distruzione meccanica del cristallino e dei prodotti metabolici escreti dai parassiti, riducendo la vista dell’ospite. L’infestazione da D. spathaceum nel pesce è associata anche a modificazioni del comportamento dell’ospite, come l’aumento dell’attività, la migrazione verso la superficie dell’acqua e la diminuzione della responsività agli stimoli visivi, mentre la capacità di nuotare non viene alterata. In questo modo, lesionando importanti organi di senso, D. spathaceum è in grado di alterare i meccanismi antipredatori fondamentali del pesce, in modo da aumentare la vulnerabilità dell’OI nei confronti di quello definitivo. D. spathaceum è un parassita cosmopolita che infesta parecchie specie di pesci, con alte prevalenze ed intensità in certi ospiti. Anche se gli effetti patologici della diplostomiasi vengono documentati raramente nei pesci selvatici, in parte perché gli individui con alte cariche parassitarie vengono rimossi dalla popolazione tramite la predazione, le epizoozie da D. spathaceum possono raggiungere livelli molto gravi nei pesci in cattività, soprattutto negli allevamenti di salmonidi come la trota arcobaleno (Oncorhynchus mykiss). Dal momento che le cercarie di D. spathaceum non cercano attivamente l’ospite e spesso sono distribuite casualmente, il comportamento di evitare questa fonte d’infestazione è il meccanismo primario di difesa mostrato dal pesce ospite. Come risultato dell’esposizione elevata e continua alle larve parassitarie, D. spathaceum frequentemente viene ritrovato abbondantemente nei pesci d’allevamento e può causare seri problemi sanitari. Segnalazioni aneddotiche riportano che le trote arcobaleno gravemente infestate da D. spathaceum non rispondono alle esche da pesca, riducendone l’utilizzabilità nella pesca sportiva.

Echinococcus

Echinococcus granulosus

L’echinococcosi è causata dall’infestazione da cisti (metacestodi) del cestode Echinococcus. Questi parassiti hanno un ciclo biologico a due ospiti mammiferi. L’OD è un carnivoro in cui i cestodi adulti albergano nel piccolo intestino. Le uova sono eliminate con le feci e vengono ingerite accidentalmente dall’OI, in cui schiudono e si sviluppano in cisti idatidee nei polmoni, nel fegato ed in altri organi interni. L’OD s’infesta nel momento della predazione di quello intermedio. Attualmente si conoscono molte specie di Echinococcus, anche se ci sono numerosi stipiti genetici intraspecifici. Echinococcus ha un ristretto range di OD, costituito soprattutto da canidi domestici e selvatici, ma ha una distribuzione cosmopolita, essendo virtualmente presente in tutti i continenti. I metacestodi sono generalmente meno ospite-specifici delle tenie, potendo sviluppare in molti erbivori ed onnivori, come uomo, pecora, bovino e cavallo.

E. granulosus ed E. multilocularis sono le specie più importanti per le implicazioni di salute pubblica e per la distribuzione geografica. E. granulosus infesta principalmente gli animali domestici, avendo il cane come OD e la pecora come OI, ma può infestare anche l’uomo. E. granulosus ed E. multilocularis sono responsabili dell’echinococcosi cistica ed alveolare rispettivamente; entrambi determinano, tramite riproduzione asessuata, la formazione di un numero crescente di cisti che possono causare debilitazione ed anche risultare letali. Tra l’altro gli OI possono risultare più vulnerabili ai predatori, tra cui gli OD del parassita. L’ipotesi che l’echinococcosi possa aumentare la vulnerabilità ai predatori deriva dalla segnalazione aneddotica di Crisler (1956) secondo cui un caribù (Rangifer tarandus) non riuscì a fuggire dai lupi. La necroscopia rivelò che i polmoni erano infestati da un numero notevole di cisti di E. granulosus. Analogamente le alci (Alces alces) possono presentare infestazioni polmonari massive che determinano una resistenza inferiore degli animali allorché cercano di sottrarsi alla caccia dei lupi (Canis lupus), OD di E. granulosus. Lupi ed altri carnivori predano selettivamente gli animali più deboli e le alci con idatidosi possono risultare più vulnerabili alla predazione. Ciononostante nessuno studio ha mai dimostrato empiricamente un legame diretto tra l’infestazione idatidea, l’aumento del rischio di predazione ed i tassi superiori di trasmissione del parassita. Gli organi interni come i polmoni sono tra i primi ad essere mangiati da parte dei grossi carnivori come i lupi. Pertanto è probabile che la selezione naturale abbia favorito la localizzazione delle cisti parassitarie in questi siti per garantire un rapido consumo da parte dell’ospite definitivo piuttosto che assicurare la probabilità della trasmissione. Comunque sia è evidente l’effetto patologico dell’echinococcosi di modificare il comportamento di fuga dell’OI in modo di aumentarne la predazione e conseguentemente la trasmissione del parassita.

E. multilocularis è un parassita formidabile, perché la forma larvale stabilisce nell’OI una serie di complessi meccanismi che, se da una parte ne promuovono lo sviluppo e la diffusione, dall’altra si estrinsecano con alterazioni patologiche limitate, consentendo una sopravvivenza prolungata dell’ospite e quindi del parassita stesso. Questi meccanismi coinvolgono le interrelazioni tra molecole di superficie e prodotti metabolici del parassita da una parte ed il sistema immunitario (soprattutto la componente cellulo-mediata) dell’ospite dall’altra. Infatti è stato dimostrato che nei roditori di laboratorio con immunità cellulare deficiente e nei pazienti umani HIV positivi, l’infestazione non segue il normale corso in equilibrio, ma assume forme più gravi e potenzialmente fatali. E si può speculare che questo possa dipendere da una perturbazione dei meccanismi evolutivi che hanno portato il metabolismo del parassita ad adattarsi alle difese dei suoi ospiti, e quindi non può reagire altrettanto bene quando si trova in un ambiente immunitario alterato.

Toxoplasma gondii

Tachizoite di Toxoplasma gondii

Le alterazioni comportamentali dell’ospite in seguito all’infestazione parassitaria, talvolta si manifestano proprio come se l’ospite agisse a vantaggio del parassita impegnandosi alla sua trasmissione. Questo è tipico delle modificazioni comportamentali indotte da T. gondii nel suo ospite, influenzando la trasmissione all’OD. T. gondii è un protozoo intracellulare cosmopolita in grado d’infettare tutti i vertebrati endotermi. Il parassita ha un ciclo biologico complesso in cui i felidi – soprattutto il gatto – rappresentano gli OD. Le oocisti che raggiungono l’ambiente con le feci dell’ospite sono resistenti, potendo restare infettanti per più di un anno. Durante questo tempo debbono essere ingerite da un altro ospite, che può essere rappresentato da un altro gatto (in cui il parassita invade le cellule intestinali, matura e poi produce sessualmente nuove oocisti) o da un OI.

Benché possano essere infettati molti organismi endotermi (roditori, uccelli, uomini), i roditori selvatici rappresentano gli OI naturali di T. gondii. Nella fase acuta dell’infezione il parassita penetra nell’intestino, va incontro ad un processo di riproduzione asessuata ed entra nei macrofagi attraverso i quali viene trasportato nei siti d’elezione per l’incistamento. Quindi il parassita dà origine a cisti resistenti in diversi organi del proprio ospite intermedio, soprattutto a livello del cervello; queste cisti possono persistere per tutta la vita dell’ospite infetto. Il parassita completa il proprio ciclo allorché un gatto si ciba dei tessuti incistati. Anche se la sopravvivenza di T. gondii non è strettamente dipendente dal proprio OD e può essere mantenuto nel tempo nelle popolazioni di OI tramite la trasmissione congenita, il cannibalismo o la predazione interspecifica, la sua infettività aumenta dopo ogni episodio di riproduzione sessuata. Dal momento che questa si verifica solo nell’OD, il parassita in definitiva è dipendente dalla predazione degli animali infetti da parte del gatto. Conseguentemente ci può essere una forte pressione selettiva per la trasmissione all’OD e dunque per lo sviluppo da parte del parassita di meccanismi che promuovono la trasmissibilità dagli OI ai gatti.

La toxoplasmosi latente è stata a lungo considerata un’infezione inapparente in ospiti immunocompetenti. Ma studi recenti hanno dimostrato che l’infezione cronica da T. gondii può indurre alterazioni comportamentali degli ospiti infetti. Nei roditori il parassita determina un aumento dei livelli d’attività ed una diminuzione della neofobia (paura delle novità) e dell’ansia; caratteristiche che potenzialmente possono aumentare la possibilità della trasmissione agli OD. Dato che T. gondii preferenzialmente invade e si incista nel cervello dei propri OI, le alterazioni comportamentali (aumento dell’attività e perdita della neofobia) osservate nei ratti selvatici infetti, originariamente sono state attribuite all’encefalite. Ma altri parassiti cerebrali a trasmissione diretta (la cui trasmissione non dipende dalla predazione dell’ospite) dei ratti selvatici sembra non inducano modificazioni del comportamento. I ratti sono fortemente neofobici e mostrano un’innata reazione d’avversione all’odore di gatto, anche dopo diverse centinaia di generazioni senza esposizione al predatore. Una tale tendenza anti-predatoria è un chiaro ostacolo alla trasmissione di T. gondii e può rappresentare un bersaglio primario per la manipolazione parassitaria. I ratti infetti non solo perdono la naturale avversione all’odore di gatto, ma addirittura pare che ne siano specificamente attratti, anche se altre caratteristiche comportamentali (come l’atteggiamento sociale e riproduttivo) restano inalterate.

Anche se ci sono studi che forniscono prove convincenti sulla capacità di T. gondii di alterare il comportamento dei propri OI, due questioni fondamentali sono ancora senza risposta. In primo luogo, i tassi effettivi di predazione dell’OD nei confronti dei ratti infetti e non infetti in natura attualmente sono sconosciuti e richiedono ulteriori ricerche. Testare il legame reale tra la manipolazione dell’ospite e l’aumento della trasmissione (cioè l’aumento della predazione) in condizioni naturali, è la base delle ipotesi sulla manipolazione. In secondo luogo, non sono ancora chiariti i meccanismi attraverso i quali T. gondii colpisce il SNC dell’ospite e riesce ad alterarlo nei modi descritti. Gli effetti dannosi della toxoplasmosi latente nell’uomo comprendono la meningoencefalite, i cambiamenti di personalità, la diminuzione del quoziente intellettivo, la riduzione delle prestazioni psicomotorie ed i disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia. È probabile che, per indurre le alterazioni comportamentali, siano necessarie la secrezione di sostanze chimiche e/o l’alterazione della produzione di neurotrasmettitori da parte di T. gondii, dal momento che il solo effetto fisico della presenza delle cisti nel cervello, è improbabile che sia sufficiente a determinare tali complesse e specifiche alterazioni dei comportamenti innati dell’OI. Negli ospiti infetti si registrano cambiamenti dell’espressione dei recettori cerebrali dopaminergici ed ansiogeni, dei livelli di neurotrasmettitori (come la dopamina) e delle concentrazioni di noradrenalina e testosterone.

Anche se gli effetti della toxoplasmosi sul cervello sono stati investigati a fondo, le vie attraverso cui T. gondii altera il comportamento dell’ospite, restano poco chiare. Per esempio, l’invasione preferenziale di diversi siti cerebrali da parte di ceppi differenti di T. gondii può influenzare la gravità della patologia. Inoltre il decorso dell’infezione è strettamente dipendente dalle caratteristiche sia del parassita che dell’ospite; nell’uomo e nei roditori di laboratorio, diverse linee genetiche di T. gondii possono manifestare differenze di virulenza. Per comprendere a fondo i meccanismi attraverso cui il parassita riesce ad indurre le alterazioni comportamentali, è essenziale una combinazione di studi neurochimici e comportamentali, che tengano presente sia l’ospite che i ceppi genetici parassitari.

Conclusioni

Da quando van Dobben (1952) riportò che pesci ospiti delle larve del cestode Ligula intestinalis erano significativamente più soggetti ad essere catturati dai cormorani (OD) rispetto ai pesci non infestati, è stato sospettato che i parassiti possano manipolare i propri ospiti. Da allora sono stati documentati diversi esempi di modificazioni indotte dai parassiti in parecchie associazioni ospite-parassita, tra cui anche specie d’importanza medica e veterinaria. Alcune patologie, come la rabbia e l’echinococcosi, destano particolare preoccupazione a causa della recente riemergenza, l’ampia distribuzione spaziale e le implicazioni per la salute pubblica. Le alterazioni indotte dai parassiti sono state spesso considerate manipolazioni parassitarie adattative che aumentano i tassi di trasmissione degli agenti patogeni. Tuttavia i meccanismi, in particolare dal punto di vista neurologico, alla base di queste alterazioni comportamentali, solo di recente hanno iniziato ad essere delucidati. Argomento centrale resta il modo in cui un patogeno possa alterare il fenotipo del proprio ospite. Capire tali meccanismi è vitale per rispondere a domande evoluzionistiche fondamentali. Senza dimenticare che la comprensione delle strategie parassitarie di trasmissione rappresenta la base per gli aspetti applicati della parassitologia, ovvero la terapia delle patologie associate. L’utilizzo della proteomica per studiare le proteine prodotte dai parassiti manipolatori e le alterazioni comportamentali dell’ospite, offre nuove prospettive per lo studio della manipolazione parassitaria. Gli studi futuri certamente trarranno beneficio dall’attenzione alle interrelazioni molecolari (soprattutto per i meccanismi neurochimici) tra gli ospiti ed i propri parassiti manipolatori.

Riferimenti:

1. Lagrue C., Poulin R. – Manipulative parasites in the world of veterinary science: implications for epidemiology and pathology – Vet J. 2010;183(3):9-13 [abstract];
2. Puccini V. – Guida alle malattie parassitarie degli animali domestici (3^a ed.) – Edagricole, 1992;
3. Crisler L. – Observations of wolves hunting caribou – J Mammalogy 1956;37:337-46;
4. Dubey J.P. – Toxoplasmosis of animals and humans (2^nd ed.) – CRC Press, 2010;
5. van Dobben W.H. – The food of the cormorant in the Netherlands – Ardea 1952;40:1-63;
6. Mejri N., Hemphill A., Gottstein B. – Triggering and modulation of the host-parasite interplay by Echinococcus multilocularis: a review – Parasitology. 2010;137(3):557-68 [abstract].

L’esplosione dei concetti dell’EBM ha portato troppo spesso alla pubblicazione di lavori (sia libri che singoli articoli) in cui viene data esclusiva importanza a quello che risulta dalla letteratura, tralasciando un minimo di integrazione con le esperienze più valide della pratica quotidiana. In realtà, nel corso del tempo, la visione integralista dell’EBM è andata scemando ed è chiaro che le evidenze scientifiche non possono prescindere dalla considerazione clinica specifica e dalla sapiente applicazione mediata dall’esperienza (sito della GIMBE). Oggi però è troppo difficile trovare dei libri che vadano oltre le semplici revisioni bibliografiche, tanto che viene da chiedersi che senso abbia un libro in cui i semplici e vituperati pareri di esperti non hanno più posto. Spendere centinaia di euro per una pubblicazione che più o meno ti dice le stesse cose di una ricerca su PubMed ben condotta, non ha molto senso (la stragrande maggioranza degli articoli è disponibile liberamente solo in forma di abstract, ma quasi sempre i concetti di fondo di un articolo sono condensati lì). Quando si compra un libro, lo si fa anche per il nome e la fama dell’autore e ci si aspetterebbe che ci dicesse qualcosa di personale ed utile, magari proprio in relazione all’applicazione pratica delle evidenze scientifiche. Altrimenti si rischia di pagare a peso d’oro qualcosa che dopo pochi mesi è superato. Per non parlare poi delle edizioni italiane di libri scritti in inglese: traduzioni non sempre all’altezza, edizioni tronche e mutilate rispetto all’originale (avete presente il Greene di malattie infettive che da noi è arrivato solo con le malattie batteriche e parassitarie?) e via aberrando.

Ma torniamo all’inizio. Nell’editoriale del numero di aprile 2008 di Compendium – Continuing Education for Veterinarian, Thomas K. Graves fa un’ottima rassegna dei metodi più opportuni per valutare l’attendibilità delle referenze bibliografiche.

Amore alla prima citazione: guida alle referenze bibliografiche per il lettore serio

Prof. Thomas K. Graves

Diversi anni fa, mentre leggevo una review sul trattamento dell’ipertiroidismo felino, trovai una frase, debitamente referenziata, secondo cui il metimazolo causa una disfunzione piastrinica nel gatto. Fui tutto eccitato nel constatare che il problema del sanguinamento nei gatti non trombocitopenici sotto terapia con metimazolo era stato risolto, ma fui anche un po’ deluso perché nel mio laboratorio avevamo lavorato per trovare una risposta a questo problema, ma senza successo. Andai all’ultima pagina dell’articolo, ansioso di controllare il riferimento e, con mia grande sorpresa, scoprii che per quella frase era stata citata una mia pubblicazione (1). In quel riferimento (il capitolo di un libro) avevo affermato che alcuni gatti sotto terapia con metimazolo mostrano problemi di sanguinamento nonostante la piastrinemia normale – affermazione che avevo attentamente referenziato (2) – e che erano in corso degli studi per indagare gli effetti del metimazolo sulla funzione piastrinica. Dopo essermi ripreso, sentendomi colpevole, andai a controllare il capitolo originale per essere sicuro di non avere detto qualcosa d’ingannevole. Nel capitolo avevo suggerito che il metimazolo potesse causare una disfunzione piastrinica, ma chiarendo che erano necessari studi ulteriori (1).

Le imprecisioni nelle citazioni degli articoli delle riviste sono frequenti (3,4), non solo in medicina veterinaria, ma probabilmente in tutti i campi. L’analisi accurata dei riferimenti da parte degli editori e dei revisori può ridurre la frequenza degli errori nelle citazioni (5) ma non li può eliminare del tutto. Controllare il contenuto effettivo di ogni citazione e determinarne la validità come riferimento, rappresenta certamente un lavoro impossibile per uno staff editoriale. Dipende dalla responsabilità degli autori. Questi, essendo umani, spesso non si assumono questa responsabilità, lasciandola al lettore che deve controllare la validità delle affermazioni referenziate. Una lunga lista di citazioni può dare l’impressione che un manoscritto sia stato curato a fondo da parte degli autori, ma non è sempre così. Di contro, una lista breve non deve per forza essere considerata inadeguata, in quanto i riferimenti possono essere di buona qualità ed applicati accuratamente. Ma allora come fa il lettore a sapere se questi numerini possono assicurare il valore di un’affermazione o devono destare sospetti?

Il metodo migliore per stabilire la qualità di un riferimento è leggerlo. Ovviamente questo è impossibile per la maggior parte di noi. Anche se avessi tanto tempo libero, dubito che lo vorrei spendere nel cercare le pubblicazioni originali. Comunque mi assicuro sempre di controllare almeno alcune caratteristiche che mi possano dare un indizio sulla qualità generale delle citazioni di un articolo. Quelle che seguono sono le cose che guardo.

Capitoli di libri. Citare i capitoli dei libri è una pratica frequente nella letteratura biomedica. Lo faccio spesso anch’io nei miei articoli, ma non sempre è giustificato farlo. Per esempio, recentemente ho letto un articolo su una stimata rivista di dermatologia, contenente l’affermazione che l’ipotiroidismo è la più frequente patologia endocrina del cane. Quest’asserzione si trova spesso nella letteratura endocrinologica veterinaria, ed è una delle mie fissazioni. Secondo me l’ipotiroidismo è molto meno frequente di quanto pensi la maggior parte dei veterinari, anche se è di sicuro la malattia endocrina del cane diagnosticata più spesso (non necessariamente correttamente). L’affermazione dell’articolo di dermatologia era supportata dal riferimento ad un capitolo sull’ipotiroidismo in un manuale. In realtà il capitolo non dice nulla del genere: contiene una tabella che mostra che il diabete mellito è la sindrome di deficienza ormonale vista più di frequente nella pratica dell’autore. La citazione nella rivista di dermatologia era chiaramente travisata.
Nello stesso articolo ho trovato un’affermazione secondo cui i pazienti ipotiroidei possono manifestare dermatite batterica ed otite come unici segni. Trovando questa cosa difficile da credere, ho controllato la citazione. Il riferimento era un altro capitolo di un manuale. Sono andato a vedere il capitolo nella sesta edizione del libro, trovando che citava la quinta edizione. La quinta edizione citava la quarta. La quarta citava la terza. Nella terza edizione, la frase su cui m’era sorto il dubbio, era referenziata dai dati dell’autore non pubblicati e da un oscuro articolo – vecchio di 27 anni – di una ricerca sui topi. Ho scovato l’articolo murino ed ho scoperto che non aveva niente a che vedere con l’ipotiroidismo, per cui si è trattato di una citazione sbagliata fin dall’inizio. Questo è chiaramente un caso limite, ma i riferimenti ai capitoli dei libri vanno sempre visti con una certa dose di sospetto, in particolar modo se vengono fatte affermazioni discutibili. I capitoli dei manuali non sono soggetti al vaglio scientifico della peer review (revisione paritaria). Spesso contengono affermazioni largamente basate sul parere di esperti. Come autore di numerosi capitoli, sono certamente colpevole anch’io di questo.

Pubblicazioni peer review non arbitrate. Ci sono diversi livelli di peer review. Il più alto livello di controllo è proprio delle riviste con revisione ufficiale da parte di un comitato di revisione. Queste riviste in genere pubblicano l’elenco dei revisori. Altre riviste si affidano soprattutto agli editori ed ai comitati editoriali, delle volte utilizzando revisori paritari esterni, ma di solito non pubblicano la lista dei revisori. Queste sono dette riviste peer review non arbitrate. Anche se possono essere di qualità molto alta, il livello di controllo non sempre raggiunge l’eccellenza delle riviste arbitrate.

Atti. Le pubblicazioni degli atti di incontri scientifici vengono spesso utilizzate come riferimenti negli articoli. Questa pratica va considerata estremamente sospetta. Gli atti solitamente non sono peer review e neanche revisionati da un editore.

Abstract (riassunti). Gli abstract sono generalmente soggetti ad un qualche livello di revisione scientifica, ma questa non è quasi mai rigorosa come per gli articoli delle riviste arbitrate. Tra l’altro gli abstract talvolta possono essere quasi nascosti in una lista di riferimenti. Consideriamo l’esempio seguente:

Gilor C, Graves TK. Serum fructosamine does not correlate with body weight, body condition score or age in cats. J Vet Intern Med 2007;21:595.

All’occhio non sospettoso questo appare come un articolo di una rivista stimata. Non lo è. È un abstract dall’incontro annuale dell’ACVIM. Non può ricevere lo stesso peso di un articolo regolare. È anche un esempio di abstract non chiaramente identificabile come tale, come invece dovrebbe essere. Inoltre un abstract vecchio probabilmente deve essere considerato un riferimento piuttosto debole perché gli abstract che successivamente non diventano manoscritti regolari possono non essere completamente attendibili.

Riferimenti vecchi. Se un’affermazione è così basilare che un riferimento vecchio di decadi è sufficiente per supportarne la validità, probabilmente non necessita di alcun riferimento. D’altronde i riferimenti vecchi rischiano di essere datati.

Tesi. I riferimenti alle tesi dei master o di laurea talvolta vanno guardati con sospetto. Si suppone che una tesi di laurea sia soggetta alla revisione da parte di una commissione di laurea, ma chiaramente non è la stessa cosa di un processo di peer review anonimo. Se viene citata una vecchia tesi, ci si deve chiedere perché nessuna pubblicazione su riviste arbitrate è scaturita da quel lavoro.

Auto-referenzialità. A volte un autore può essere la sola persona che è solita fare pubblicazioni su un certo argomento, per cui non può fare altro che citare i propri lavori. Un riferimento o due da parte dell’autore principale dell’articolo sono buona cosa. Permettono al lettore di conoscere qualcosa sul background e la competenza dell’autore. Tuttavia troppa auto-referenzialità può essere indice di miopia intellettuale.

Comunicazioni personali. I riferimenti a comunicazioni personali forniscono praticamente il supporto più debole possibile per un’affermazione di un articolo.

Osservazioni non pubblicate. Come le comunicazioni personali, anche i riferimenti alle osservazioni non pubblicate probabilmente non dovrebbero essere usati, a meno che riguardino qualcosa che non influisce sul significato dell’articolo o sull’interpretazione dei dati.

Ogni riferimento fornito può essere perfettamente valido, ma un certo grado di diffidenza è salutare se ci accompagna nella lettura della letteratura scientifica. La maggior parte degli editori delle riviste veterinarie fa un lavoro eccellente nella considerazione dell’accuratezza e dell’appropriatezza dei riferimenti. Sfortunatamente alcuni riferimenti non sono adeguati. È necessario un alto livello di competenza non solo per gli autori, gli editori ed i revisori, ma anche per i lettori. Personalmente penso che sia una buona cosa.

Riferimenti:

1. Graves TK. Complications of treatment and concurrent illness associated with hyperthyroidism in cats. In: Bonagura JD, ed. Kirk’s Current Veterinary Therapy XII. Philadelphia:WB Saunders; 1995:369-372;
2. Peterson ME, Kintzer PP, Hurvitz AI. Methimazole treatment of 262 cats with hyperthyroidism. J Vet InternMed 1988;2:150-157;
3. Hinchcliff KW, Bruce NJ, Powers JD, Kipp ML. Accuracy of references and quotations in veterinary journals. JAVMA 1993;202:397-400;
4. Wager E,Middleton P.Technical editing of research reports in biomedical journals. Cochrane Database Syst Rev 18:MR000002, 2007;
5. Wager E, Middleton P. Effects of technical editing in biomedical journals: a systematic review. JAMA 2002;287:2821-2824;
6. 6. Feldman EC, Nelson RW. Hypothyroidism. In: Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. 3rd ed. St. Louis: Saunders; 2004:86-151.

Personalmente c’è un’altra cosa che controllo sempre ed ancor prima di iniziare a leggere: eventuali conflitti d’interesse, sponsorizzazioni o se tra gli autori ci sono dipendenti di ditte farmaceutiche. Nessuno pensa male a prescindere, ma mi si conceda che, mettiamo, tra due lavori che trattano l’efficacia di un principio attivo per una data patologia, ammesso che siano condotti con gli stessi criteri di rigore scientifico, consideri in maniera diversa i risultati di quello del tutto indipendente rispetto a quello sponsorizzato o con autori dipendenti. Non credo che questi ultimi lavori siano falsi, anzi, sono sicuro che non lo siano. Ma sinceramente non ho ricordanza di aver letto un giudizio, o anche solo l’evidenza (o la sottolineatura) di risultati negativi in questo tipo di articoli. E non dico neppure che vengano omessi completamente eventuali risultati negativi; è sufficiente dare un peso diverso ai risultati positivi ed a quelli negativi, a partire dal titolo per finire alla discussione. Infine sarebbe opportuno anche dare il giusto peso ad una pubblicazione in relazione all’autore o agli autori: di solito se un autore ha già pubblicato decine di lavori su riviste peer review, quello che dice deve essere considerato in un’ottica diversa rispetto ad un autore con poche pubblicazioni alle spalle.

In ogni caso è sempre necessaria un po’ di quella che Graves chiama diffidenza, perché, anche controllando tutto il controllabile, i lavori possono sempre essere imprecisi, sbagliati, incompleti, travisati, pretestuosi o addirittura in malafede. Fortunatamente il controllo non si limita ai comitati editoriali prima della pubblicazione, ma si estende anche alla fase post-pubblicazione e sono i lettori che possono individuare lavori indegni e segnalarli, per esempio, con le lettere alle riviste.

The landscape of canine stifle disease remains relatively unchanged despite decades of research, billions of consumer dollars, and generations of affected dogs… It is time to use the expertise and skills honed from decades of patient care and investigation to cut the fishing line and shift the paradigm of canine CCL disease. The reports featured in this 2-part special issue highlight the creativity, knowledge, and technology being directed to canine CCL disease.

[ Prima parte - Seconda parte ]

Scopo di questo studio è stato di investigare la prevalenza, le manifestazioni cliniche ed i fattori di rischio associati ad insufficienza renale acuta nei pazienti affetti da VL.I soggetti sono stati trattati con iniezioni endovenose di Glucantime^® (AnM, 20 mg/kg/die per 20-40 giorni) e, nei casi gravi, di amfotericina B (AmB, dose totale 7-20 mg/kg fino a 20 giorni); ai pazienti con infezioni secondarie sono stati somministrati antibiotici. Sono stati inclusi 224 soggetti (età 36 ± 15 anni, range 15-84) di cui il 76,8% erano maschi.

L'insufficienza renale acuta (IRA) è stata osservata in 76 pazienti (33,9%) di cui l'85,5% erano maschi e 26 (34,2%) avevano una creatininemia superiore a 1,4 mg/dl al momento dell'accesso in ospedale; 39 soggetti (51,3%) hanno sviluppato IRA entro una media di 10 giorni dall'inizio della terapia con AmB, 7 (9,2%) con AnM e 4 (5,3%) per altre cause. I pazienti in IRA rispetto a quelli non-IRA hanno mostrato livelli superiori di BUN, creatininemia, kaliemia, bilirubinemia diretta ed indiretta e WBC; mentre livelli inferiori di natriemia, bicarbonatemia, pCO₂, albuminemia, piastrinemia e tempo di protrombina. I fattori chiaramente associati ad IRA sono risultati il genere maschile, l'età avanzata, l'ittero e la somministrazione di AmB. Questo farmaco nefrotossico in Brasile è la seconda scelta nei casi di VL. È stata osservata un'associazione significativa tra il suo utilizzo e l'IRA nei pazienti che non avevano risposto all'AnM: l'IRA è stata osservata in 39 soggetti trattati con AmB (l'82,9% dei trattati col farmaco, ovvero il 17,4% di tutti i soggetti). Il 20,9% ha ricevuto AnM e AmB; tutti i pazienti trattati con AmB avevano le creatininemia normale all'ammissione; la somministrazione di AnM è stata associata con una minore incidenza di IRA (AmB: 39 pazienti IRA [51,3%], 8 non-IRA [5,4%]; AnM: 37 IRA [48,7%], 140 non-ira [94,6%]). La mortalità totale è risultata del 13,3% (30 soggetti), significativamente più alta nei pazienti IRA (23 [30,2%]) rispetto ai non-IRA (7 [3,1%]). I fattori di rischio di morte sono risultati la somministrazione di AmB, l'oliguria, l'ittero e la dispnea.

Il coinvolgimento renale nella VL è considerato raro e si presenta con ematuria, proteinuria od alterazioni della funzionalità renale. In letteratura esistono scarse informazioni sull'associazione IRA – VL. Uno studio ha rilevato alterazioni renali in solo 1 paziente su 11 (11%) considerando la creatininemia > 1,4 mg/dl. Il presente studio ha rilevato un'incidenza superiore di IRA (33,9%) nei pazienti con diagnosi di VL accertata. In uno studio recente le alterazioni renali (creatininemia > 1,3 mg/dl) sono state riscontrate nel 26,2% di 57 pazienti con VL. In un altro lavoro è stata riscontrata una diminuzione di GFR nel 28% di 50 soggetti e la causa è stata attribuita alla perdita di liquidi, alla contrazione del volume ed alla patologia glomerulare immunomediata.

HCO₃ e pCO₂ sono risultati inferiori nei pazienti IRA, suggerendo un'alta incidenza di acidosi metabolica probabilmente secondaria alla disfunzione renale. Uno dei dati salienti emersi dallo studio è la forte associazione tra AmB (non liposomiale) ed IRA: i pazienti trattati con AmB hanno un rischio 18 volte superiore di andare in IRA. Questo è emerso anche in altri lavori con percentuali dei pazienti trattati con AmB ed andati incontro ad IRA che oscillano intorno all'80%.

(Risk factors for acute kidney injury in visceral leishmaniasis (Kala-Azar) – Oliveira MJ, Silva Júnior GB, Abreu KL, Rocha NA, Garcia AV, Franco LF, Mota RM, Libório AB, Daher EF – Am J Trop Med Hyg. 2010;82(3):449-53 [abstract])

Il fenotipo morfologico dell’anca di un cane è il risultato combinato degli effetti di un numero imprecisato di fattori genetici e non genetici (“ambientali”). Fattori ambientali, come rapida crescita ed alimentazione eccessiva, sono stati associati con lo sviluppo della DdA, mentre soggetti cresciuti con dieta controllata mostrano risultati della DdA significativamente inferiori, così come un’osteoartrite di minor gravità rispetto ai cani alimentati senza controllo. Le differenze morfologiche delle razze – per quanto riguarda altezza, peso, lunghezza e statura – hanno possibili influenze sul carico dell’articolazione coxo-femorale. Appare dunque logica l’ipotesi che le differenze di conformazione dettate dagli standard di razza possano rappresentare un altro fattore che contribuisce alla predisposizione alle patologie muscolo-scheletriche come la DdA; ed è supportata dall’osservazione che una caratteristica morfologica, l’indice di mazza corporea (BMI), dei cani di diverse razze, è significativamente correlato con l’incidenza della DdA. Da qui scaturisce la questione se l’aumento del rapporto peso/altezza possa portare ad una maggiore predisposizione di alcune razze alla DdA. Gli autori hanno ipotizzato che uno di questi fattori, il rapporto lunghezza/altezza del corpo (L/A), possa influenzare l’espressione della DdA in certe razze. La lunghezza relativa del corpo è indirettamente correlata al BMI, dal momento che un cane più lungo ha il potenziale di sopportare un maggior peso in relazione alla sua altezza rispetto ad un soggetto di razza simile ma dalla forma più quadrata. Il ruolo della selezione per le caratteristiche morfologiche apprezzate nelle mostre e dettate dagli standard di razza non è mai stato esaminato a fondo.  Questo studio ha messo in correlazione i risultati pubblicati della patologia dell’anca con le misurazioni del rapporto L/A del corpo ottenute dalle fotografie dei soggetti campioni di 30 razze per stabilire se i criteri di selezione possono compromettere il benessere aumentando la predisposizione alla DdA.

I risultati sono chiari: la lunghezza relativa del corpo è in forte correlazione con gli accresciuti tassi di DdA ottenuti dai dati di razza dell’Orthopedic Foundation for Animals (USA), della BVA (UK) e dell’Australian Veterinary Association (Australia), suggerendo decisamente che le proporzioni delle razze con corpo lungo le possano predisporre alla DdA. Tra l’altro i dati analizzati provengono da programmi volontari, per cui sono a rischio di auto-selezione, essendo improbabile che vengano sottoposti a screening radiografico i soggetti con DdA clinicamente manifesta.

C’è da dire che anche se i risultati dello studio indicano chiaramente l’associazione tra alto rapporto L/A e DdA, questo non può essere generalizzato a tutti i canidi; del resto una tale conformazione (si vedano i Dobermann campioni) non è comune in natura: è vero che la volpe ha un elevato L/A, ma di solito pesa meno di 10 Kg. Relativamente ai paragoni con la morfologia dei canidi selvatici, bisogna tenere a mente una differenza fondamentale: gli animali selvatici sono il prodotto della selezione naturale nei confronti delle funzioni adattative (all’ambiente), mentre la conformazione delle attuali razze canine è stata artificialmente selezionata quasi solo in base a principi estetici. Quando gli allevatori delle razze a corpo lungo delle origini selezionavano per questa conformazione, purtroppo non hanno tenuto nella debita considerazione anche l’anatomia necessaria per sopportare questi cambiamenti.

Nel favorire morfotipi più lunghi che alti, i giudici possono aver selezionato involontariamente attributi conformazionali che predispongono i cani alla DdA; e questo suggerisce che le ambiguità negli standard di razza ed i fenotipi estremi di lunghezza relativa del corpo possono determinare gravi conseguenze per il benessere e debbono essere rivisti drasticamente. E questo per due ragioni fondamentali. In primo luogo: molti standard attuali alludono al fatto che sono desiderabili soggetti più lunghi che alti (per esempio lo standard del Mastino Napoletano dice che i soggetti devono essere il 10-15% più lunghi che alti) ed i giudici delle mostre premiano prontamente l’aspetto rettangolare che è tipico di molte delle razze che oggi sono afflitte dalla DdA, come il Basset Hound ed il Dogue de Bordeaux. In secondo luogo: in tutti e tre i continenti valutati in questo studio, l’ambiguità degli standard di razza sulle proporzioni prescritte, o la totale assenza di informazioni in questo senso, lasciano troppo spazio all’interpretazione da parte dei giudici e degli allevatori, promuovendo la selezione insistita dei morfotipi estremi. La forte correlazione di questa variabile morfologica con la prevalenza della patologia, insieme a tutta una serie di altri disordini ereditari che accompagnano i fenotipi canini estremi, indicano che le descrizioni vaghe e le caratteristiche soggettive mettono a repentaglio la salute ed il benessere del cane. Ricerche ulteriori dovrebbero sostenere lo sviluppo di standard di razza completi, con specifiche linee guida morfologiche orientate alla salute, per aiutare gli allevatori ad ottenere fenotipi più sostenibili ed adattativi. In questo processo è imperativa l’umiltà, perché chi si dedica all’allevamento del cane deve abbracciare l’idea che le morfologie maladattative, che storicamente sono state considerate caratteristiche della razza ideale, devono essere abbandonate, se veramente si vuole che tra le priorità ci siano la salute ed il benessere del cane.

(Selection for breed-specific long-bodied phenotypes is associated with increased expression of canine hip dysplasia – Vet J. 2010;183(3):266-72 [abstract])

Meningite cronica da Leishmania.

Al congresso Gemi-Geo 2010, che si è tenuto lo scorso aprile ad Avignone, sono stati riportati 3 casi di meningite da Leishmania nel cane (comunicazione breve in francese). Sono stati visitati tre soggetti di sesso femminile (Dora, un Épagneul Breton di 1,5 anni e due Border Collie di 5 [Missi] e 9 anni [Vanka]) per problemi neurologici: Dora presentava una sindrome algica recidivante, Missi ipertermia e dolori toraco-addominali e Vanka era in tetraparesi. La citologia del LCS rivelava pleiocitosi corrispondente ad un infiltrato infiammatorio di cellule mononucleate (macrofagi e cellule linfoidi). La PCR sul LCS per cimurro, toxoplasmosi, neosporosi, ehrlichiosi e leishmaniosi, era positiva solo per quest’ultima; mentre la sierologia su sangue era negativa nei due soggetti in cui era stata eseguita. La terapia – prednisolone, AnM ed allopurinolo – permetteva un rapido miglioramento in tutti e tre i pazienti. In uno, la PCR su LCS dopo 8 giorni di terapia (il cortisonico era stato interrotto da 4 giorni), dava risultato negativo e la citologia mostrava una netta diminuzione della cellularità.

Le foglie fresche sono state tritate e riscaldate in acqua distillata al 20% (w/v) per 30' a 50 °C, quindi l'estratto acquoso è stato lipofilizzato e ricostituito con PBS prima dell'uso. Dopo aver infettato i topi per via EV con 10⁷ promastigoti di L. chagasi, sono stati sottoposti al trattamento orale giornaliero (dal giorno 1 al giorno 29 post-infezione) con 400 mg/kg di estratto (Kp). Ai controlli negativi (cn) è stato somministrato il PBS (200 µl) ed a quelli positivi (cp) 72 mg/kg di stibiogluconato di sodio (Pentostam^®) – equivalenti a 20,2 mg di Sb^V/mg/kg – per via intraperitoneale a giorni alterni.

Rispetto ai cn, nei topi trattati con Kb si è registrata una carica parassitaria inferiore nella milza e nel fegato rispettivamente di 4 e 6 volte; con un'efficacia paragonabile al trattamento dei cp. Il giorno 30 post-infezione è stata valutata la produzione di anticorpi specifici (IgG) e delle classiche citochine Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-4): il gruppo test ha fatto registrare una diminuzione significativa di IgG ed IL-4 ma non di IFN-γ (nei cp invece le IgG e l'IFN-γ sono risultati inalterati e l'IL-4 è aumentata). Sia il gruppo test che i cp hanno fatto registrare un aumento di NO rispetto ai cn. La VL è comunemente associata a grave immunodepressione che non solo indebolisce le difese dell'ospite contro la malattia, ma anche la risposta al trattamento con gli antimoniali. Per questo, per trattare questa patologia, c'è urgente bisogno di sviluppare nuovi farmaci che rinforzino le risposte immunitarie e che rendano l'ospite più attivo nel killing dei parassiti intracellulari. Questo studio dimostra che l'attività osservata in precedenza di Kp nella CL è applicabile anche alla VL, utilizzando il modello murino dell'infezione, indicando l'ampio spettro nelle leishmaniosi. Anche se si tratta di un estratto grezzo dalla composizione definita solo in parte, la conoscenza crescente dell'effetto soppressivo Th2, l'attività anti-Leishmania dei componenti flavonoidi e la bassa tossicità, supportano ulteriori sviluppi dell'estratto come nuovo trattamento orale ed a basso costo per il trattamento della leishmaniosi.

(Effectiveness of the immunomodulatory extract of Kalanchoe pinnata against murine visceral leishmaniasis – Gomes DC, Muzitano MF, Costa SS, Rossi-Bergmann B – Parasitology. 2010 Apr;137(4):613-8 [abstract]).

Le sindromi cliniche causate da batteri, funghi, protozoi e virus sono frequenti nel cane e nel gatto. La diagnosi differenziale per un caso clinico, tenendo presenti gli agenti infettivi che è più probabile siano coinvolti, generalmente è determinata dalla valutazione del segnalamento, della storia e dei riscontri dell’esame clinico. Dopo aver fatto un tentativo di diagnosi clinica, il medico solitamente stabilisce di testare o trattare. Il trattamento empirico può essere accettabile in alcuni casi, come per le semplici infezioni primarie in assenza di una malattia pericolosa per la vita, soprattutto se sussistono limiti logistici od economici ad affrontare un approfondimento diagnostico impegnativo. Comunque di solito è preferibile una diagnosi definitiva, in modo che la terapia, la prevenzione, la prognosi, la gestione ed i rischi zoonosici possano essere gestiti in maniera ottimale. Sono disponibili molti test per l’uso routinario, come ausili per la diagnosi delle infezioni del cane e del gatto. I test che di solito vengono utilizzati per provare la presenza di un agente infettivo comprendono la flottazione fecale, la citologia, l’istopatologia, l’immunoistochimica, la coltura, i test antigenici e quelli molecolari. Per molti agenti infettivi sono disponibili anche test che rilevano gli anticorpi sierici.

Per utilizzare ed interpretare correttamente i metodi diagnostici, dovrebbero essere conosciuti alcuni parametri statistici propri del test. La sensibilità è la capacità di un test di rilevare un campione positivo (in altre parole: la capacità di evitare i falsi negativi); la specificità è la capacità di un test di rilevare un campione negativo (in altre parole: la capacità di evitare i falsi positivi). Il valore predittivo positivo (VPP) è la capacità del risultato di un test di predire la presenza di una malattia; il valore predittivo negativo (VPN) è la capacità del risultato di un test di predire l’assenza di una malattia. Per i valori predittivi entra in gioco anche la prevalenza della malattia nella popolazione da cui proviene il campione, ma lasciamola perdere in questa sede.

Molti degli agenti infettivi che si incontrano nella pratica, colonizzano o infettano un’ampia percentuale della popolazione animale, determinando la positività dei test sierologici anticorpali. Tuttavia l’agente eziologico può indurre la malattia clinicamente manifesta solo in un numero esiguo di animali tra quelli infetti. Esempi nel gatto includono i Coronavirus, Toxoplasma gondii e Bartonella. Benché per questi agenti siano disponibili test anticorpali dotati di buone sensibilità e specificità, il VPP è molto basso perché la maggior parte dei gatti con sierologia positiva è clinicamente normale. Per cui i test sierologici anticorpali spesso non sono buoni test di “malattie” infettive.

La PCR è uno degli ultimi test diagnostici molecolari che può essere usato per confermare la presenza di un microrganismo in un campione. La PCR amplifica piccole quantità di DNA a livelli rilevabili. Quando viene incluso un passaggio transcriptasi inversa (RT) per convertire l’RNA in DNA, il test può anche rilevare l’RNA (RT-PCR). In generale la PCR è più sensibile delle tecniche citologiche o istopatologiche ed è paragonabile alla coltura ed all’inoculazione in animali di laboratorio. La PCR è di grande valore per documentare un’infezione, soprattutto se il microrganismo in questione è difficile da coltivare (per es.: Chlamydophila felis) o non può essere coltivato (per es.: gli emoplasmi). La specificità di questo test può essere molto alta, in base ai primer (sequenze nucleotidiche) che vengono utilizzati nella reazione. Per esempio, possono essere progettati primer per rilevare tutte le specie di un genere (per es.: Ehrlichia) o una singola specie (per es.: Ehrlichia canis).

A causa della sensibilità insita nella reazione (arma a doppio taglio), la PCR può dare risultati falsi positivi se il campione è contaminato (DNA estraneo o esogeno) durante il processo di raccolta o in laboratorio durante l’esecuzione della metodica (1, 2). Si possono anche ottenere risultati falsi negativi se il campione viene manipolato impropriamente o se il paziente ha già ricevuto una precedente terapia. I risultati falsi negativi sono particolarmente importanti nel caso della RT-PCR per rilevare l’RNA dei virus. Altri problemi potenziali sono rappresentati dalla scarsa standardizzazione tra i laboratori che eseguono la PCR (per cui, per esempio, diventa difficile confrontare i risultati) e dallo scarso utilizzo di sistemi esterni di controllo di qualità (1). Per quanto riguarda la diagnosi molecolare dell’infezione da Leishmania, è sorprendente constatare che, tra le centinaia di lavori pubblicati dal 1989 al 2007, solo pochi hanno comparato i diversi protocolli disponibili, per quanto riguarda il campionamento delle biopsie, l’estrazione del DNA e l’utilizzo dei vari primer. Tra l’altro, alcune di queste prove comparative, hanno fornito risultati anche molto diversi le une dalle altre. È dunque importante usare molta cautela nella comparazione dei diversi studi, considerando il contesto clinico ed i criteri clinici e laboratoristici impiegati per la definizione dei casi e dei “non-casi”. Mancando un vero gold standard nella diagnosi di leishmaniosi, queste considerazioni possono avere importanti conseguenze nella valutazione della sensibilità e della specificità dei vari protocolli. Gli studi comparativi dovrebbero essere incoraggiati ed aggiornati agli sviluppi delle ultime tecnologie e, cosa ancora più importante, dovrebbero essere condotti in senso multicentrico, con un numero adeguato di campioni, per permettere una valutazione comparativa statisticamente attendibile (3).

Anche se la PCR può essere uno dei metodi diagnostici più sensibili per provare un’infezione, i risultati positivi non sempre dimostrano che l’infezione è la causa della patologia clinica. Per esempio, poiché la tecnica amplifica il DNA di microrganismi sia vivi che morti, possono essere ottenuti risultati positivi anche nel caso in cui l’infezione sia già stata sconfitta dall’ospite.

Nel 2007 Prina e coll. (4) hanno pubblicato i risultati di uno studio in vitro su macrofagi murini infetti da Leishmania amazonensis, trattati con estere di L-leucina (molecola che uccide rapidamente gli amastigoti intracellulari): tramite PCR real-time è stato rilevato che, già un’ora dopo il trattamento, il DNA del cinetoplasto e del nucleo subisce una diminuzione significativa, fino all’1% dei valori iniziali; la microscopia ha confermato un’analoga diminuzione degli amastigoti intracellulari, a partire da alcune ore dopo il trattamento, anche se una minima percentuale sopravvive e può, in opportune condizioni colturali, replicarsi ulteriormente. Questo risultato, pur importante, non pare però risolvere definitivamente i dubbi che in tanti hanno sollevato (5, 6, 7).

Quando il microrganismo che viene testato infetta comunemente una popolazione di animali sani, l’interpretazione dei risultati in un singolo animale può essere difficoltosa. Lappin riporta che fino al 20% dei gatti è portatore asintomatico di Candidatus Mycoplasma haemominutum, e che nel suo laboratorio è stato amplificato il DNA di Bartonella da più del 50% di gatti apparentemente sani ospitati in gattili di stati con alto rischio d’infestazione da pulci. Anche se la PCR è un metodo sensibile per dimostrare l’infezione da questi microrganismi, attualmente il VPP è molto basso.

Per alcuni agenti infettivi, i test PCR attualmente disponibili non possono discriminare tra ceppi vaccinali e ceppi di campo. Per esempio, i test PCR attualmente disponibili per FHV-1 e FCV amplificano anche i ceppi di vaccini vivi attenuati, per cui un risultato positivo ottenuto da un tampone nasale o faringeo non può indicare con certezza la presenza di un ceppo patogeno. La PCR real-time può essere utilizzata per rilevare la quantità di DNA microbico in un campione, ed è possibile che la carica di DNA sia in correlazione con la presenza della malattia per alcuni patogeni. In questo senso, per quanto riguarda la leishmaniosi umana e canina (8, 9), ci sono stati dei suggerimenti numerici (campioni di sangue), ma siamo ancora in alto mare (non c’è standardizzazione dei materiali e metodi, figuriamoci dei risultati).

Alcuni agenti infettivi, come Bartonella henselae, sono molto adattati all’ospite, per cui diversi cani e gatti hanno molte copie di DNA dell’agente nel sangue senza mostrare segni di malattia.

Secondo Lappin la maggior parte dei test PCR – come quelli anticorpali – non sono test di malattie infettive. Sono invece test di “agenti” infettivi che forniscono risultati che un veterinario può utilizzare per diagnosticare una malattia infettiva. Ritiene che sia molto importante che, per servirsi in maniera appropriata della PCR, i clinici che si occupano di piccoli animali debbano valutare attentamente VPP e VPN dei test attualmente disponibili, così come l’esperienza e l’affidabilità del laboratorio che li esegue. La diagnosi clinica di una malattia infettiva dovrebbe includere: 1) segni clinici riferibili all’agente eziologico; 2) risultato positivo alla coltura, al test antigenico, alla PCR o un’evidenza sierologica dell’esposizione all’agente; 3) esclusione di altre cause della sindrome clinica; 4) risposta al trattamento appropriato. Quando questi criteri sono soddisfatti, l’agente infettivo sospettato può essere la causa della malattia clinica. I progressi della medicina veterinaria hanno sempre portato ad un miglioramento diagnostico; comunque l’”arte” della medicina resta l’utilizzo proprio dei test e l’affiancamento ad un buon giudizio clinico. La PCR è un mezzo valido – conclude Lappin – non un indicatore infallibile.

Riferimenti:

1. Lappin M. – PCR Assays: Are They Really Infectious “Disease” Tests? – Comp Cont Ed Pract Vet. 2008;30(11):570-1;
2. Lo Y.M.D., Chan K.C.A. – Introduction to the Polymerase Chain Reaction. In “Clinical applications of PCR”, 2nd ed., ed. Y.M.D. Lo, R.W.K. Chiu, K.C.A. Chan, Humana Press, Totowa, NJ:1-10, 2006;
3. Reithinger R., Dujardin J.C. – Molecular diagnosis of leishmaniasis: current status and future applications – J Clin Microbiol. 2007;45(1):21-5 [HTML - PDF];
4. Prina E., Roux E., Mattei D., Milon G. – Leishmania DNA is rapidly degraded following parasite death: an analysis by microscopy and real-time PCR – Microbes Infect. 2007;9(11):1307-15 [abstract];
5. Guetta F. – La leishmaniose canine: actualités – VF News 2000 Oct./Déc. 3:2-9;
6. Xavier S.C., de Andrade H.M., Monte S.J.H., Chiarelli I.M., Lima W.G., Michalick M.S.M., Tafuri W.L., Tafuri W.L. – Comparison of paraffin-embedded skin biopsies from different anatomical regions as sampling methods for detection of Leishmania infection in dogs using histological, immunohistochemical and PCR methods – BMC Veterinary Research 2006;2:17 (doi:10.1186/1746-6148-2-17) [abstract - HTML - PDF];
7. Moreira M.A., Luvizotto M.C., Garcia J.F., Corbett C.E., Laurenti M.D. – Comparison of parasitological, immunological and molecular methods for the diagnosis of leishmaniasis in dogs with different clinical signs – Vet Parasitol. 2007;145(3-4):245-52 [abstract];
8. Francino O., Altet L., Sánchez-Robert E., Rodriguez A., Solano-Gallego L., Alberola J., Ferrer L., Sánchez A., Roura X. – Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis – Vet Parasitol. 2006;37(3-4):214-21 [abstract];
9. Mary C., Faraut F., Drogoul M.P., Xeridat B., Schleinitz N., Cuisenier B., Dumon H. – Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient follow-up – Am J Trop Med Hyg. 2006;75(5):858-63 [abstract - HTML - PDF].

Bestiame nei villaggi del Bangladesh

In uno studio longitudinale sulla sieroprevalenza della VL umana, condotto nella regione iperendemica di Bihar in India, non è stata trovata correlazione dello stato sierologico tra soggetti che sviluppano la malattia e quelli che non la sviluppano. Ovvero: lo stato sierologico non può essere utilizzato come predittivo dello sviluppo della malattia in soggetti asintomatici. C’è invece correlazione tra lo sviluppo della malattia ed il fatto di convivere con persone malate; più che un ruolo dei soggetti già malati come fonte di contagio per quelli sani o non infetti, gli Autori ipotizzano una predisposizione genetica su base familiare (Gidwani et al., 2009 [abstract - HTML - PDF]).

Ad una conclusione analoga erano già pervenuti Bern e coll. (2005 [abstract - HTML - PDF]) in uno studio condotto in Bangladesh. Nelle regioni meridionali dell’Asia l’uomo è considerato il  serbatoio principale di Leishmania donovani. Gli autori hanno rilevato un rischio di sviluppare la malattia 26 volte superiore nelle persone che convivono con malati di VL; la media di durata della malattia prima della terapia è risultata di 4 mesi, fornendo ampie possibilità alla trasmissione vettoriale all’interno della stessa casa. Un certo rischio è stato riscontrato anche nel raggio di 50 metri rispetto alle abitazioni con soggetti malati (per la limitazione della distanza di volo dei flebotomi). Anche gli Autori di questo studio ammettono che possono essere in causa anche altri fattori: predisposizione genetica familiare e deficienze nutrizionali (legate al fatto che all’interno della stessa abitazione l’alimentazione, in genere povera e carente, è uguale per tutti). Invece la vicinanza al bestiame (vacche e bufali) delle abitazioni è associato ad incidenze minori, probabilmente perché i flebotomi preferiscono i grossi ungulati all’uomo per il pasto di sangue. Del resto siccome questi animali non sono sensibili alla leishmaniosi, si ha una diminuzione del tasso d’infettività per i flebotomi (probabilmente è vero anche che il livello nutrizionale delle persone con le bestie nelle vicinanze è superiore). Infine l’utilizzo di reti non trattate (con insetticidi) sui letti è in relazione ad un rischio inferiore del 30% di sviluppare la malattia.

Per cercare di comprendere il reale impatto degli animali domestici (soprattutto bovini) come fattore di rischio per VL, Singh e coll. (2010) hanno condotto un ulteriore studio (sempre in Bihar), anche in considerazione del fatto che la letteratura non è affatto concorde (in alcuni lavori gli animali domestici sono fattori di rischio, in altri di protezione). Convivere durante le ore notturne con animali domestici non è risultato correlato alla VL. Invece fattori di rischio sono risultati le abitazioni con tetto di paglia e la pavimentazione umida, a prescindere dalle condizioni economiche. Per cui gli autori concludono che è importante il miglioramento delle condizioni di abitazione.