(sulla base di “How effective is dog culling in controlling zoonotic visceral leishmaniasis? A critical evaluation of the science, politics and ethics behind this public health policy” di Carlos Henrique Nery Costa, Rev. Soc. Bras. Med. Trop., ahead of print Epub Apr 01, 2011 [bibliografia nel testo originale])

1. Introduzione

La leishmaniosi viscerale (VL) (umana) è una malattia strana caratterizzata da una distribuzione geografica particolare. Nel subcontinente indiano, dove si verificano la maggior parte dei casi al mondo, la malattia è distribuita in un’area molto limitata del nordest, interessando alcuni distretti dello stato di Bihar in India, il Bangladesh ed il Nepal. Qui la malattia è esclusivamente antroponotica, cioè trasmessa unicamente tra persone. La prevalente trasmissione uomo – uomo si osserva anche in Africa orientale, soprattutto in Kenya, Sudan, Uganda ed Ethiopia. È stata antroponotica anche nelle pianure della Cina orientale, ma è stata eradicata da queste aree negli anni Cinquanta del secolo scorso. Nel resto del mondo, in particolare nelle zone montuose della Cina, in Asia Centrale, in Medio Oriente, nella Transcaucasia, nel Bacino del Mediterraneo, in America Centrale e Meridionale, è una zoonosi, cioè trasmessa tra gli animali e l’uomo. I principali serbatoi conosciuti sono cani, coyote e volpi, anche se altri mammiferi possono essere implicati nella trasmissione. Gli agenti eziologici della malattia antroponotica e zoonotica sono diversi ma molto simili, rispettivamente Leishmania donovani e L. infantum, che pare si siano evolutivamente separate un milione d’anni fa in Asia Centrale. Il parassita americano è spesso chiamato L. chagasi, ma è geneticamente identico a L. infantum, e probabilmente è stato introdotto in diverse occasioni dai coloni europei, anche se è possibile che esistano popolazioni parassitarie autoctone. Il parassita è trasmesso da alcune specie di flebotomi, che si riproducono su materiale organico solido in decomposizione, appartenenti al genere Phlebotomus nel Vecchio Mondo e Lutzomyia nelle Americhe. La distribuzione geografica del vettore determina quella della malattia, per cui i fattori che limitano la prima, dovrebbero essere gli stessi che influenzano la distribuzione della patologia. Nonostante le differenze ecologiche, la malattia è molto simile nelle varie regioni: mortale se non trattata e caratterizzata da lunghi episodi febbrili, perdita di peso, anemia, sanguinamenti, epatosplenomegalia, infezioni batteriche secondarie spesso gravi. È stato stimato che annualmente nel mondo muoiono 59.000 persone, soprattutto in India e Sudan.

Si è molto dibattuto sull’eliminazione dei cani domestici per il controllo della ZVL, ma in realtà sono stati condotti pochi studi per valutare l’efficacia di questo tipo di interventi. Una review (revisione) sistematica recentemente pubblicata sulle strategie per il controllo della patologia, passa in rassegna questi studi ed indica le direzioni che questa politica crudele dovrebbe prendere (Control of visceral leishmaniasis in latin america – A systematic review [abstract - HTML o HTML - PDF o PDF]). Dato che, malgrado questa revisione sistematica, alcuni elementi sembrano indicare che le attività che comportano l’abbattimento dei cani continueranno, l’Autore ha deciso di riesaminare questa strategia, tramite una revisione della letteratura, ristretta alle ricerche ed ai programmi che hanno coinvolto unicamente le persone. A parte la descrizione storica, sono stati considerati solo gli studi con gruppi controllo ed analisi statistiche per valutare il ruolo del cane e gli effetti delle misure di controllo.

2. Sfondo storico

2.1. Vecchio Mondo

La prima proposta di un programma di eliminazione dei cani per controllare la leishmaniosi sembra quella di Adler e Tchernomoretz (1946). Dal momento che gli autori non erano stati in grado di curare dei cani in Palestina tramite l’antimonio pentavalente o la diamidina aromatica, suggerirono di spostare i cani in altre aree o la loro eliminazione, come alternative per il controllo. Probabilmente è a causa di queste osservazioni che sono iniziate le operazioni di controllo tramite l’eliminazione dei cani. Questo concetto è stato poi sottolineato da Hoare nella sua prestigiosa rassegna del 1962. Negli anni Cinquanta iniziarono due vasti programmi di controllo della malattia in Cina e nelle repubbliche dell’Asia Centrale dell’ex Unione Sovietica, per via dell’ampia distribuzione della patologia e della sua incidenza. Tali programmi vennero implementati sotto l’egida delle politiche socialiste nell’ambito degli stati rivoluzionari e centralizzati. Anche se non ci sono dati precisi, la situazione della Cina era la peggiore e davvero desolante. È stato stimato che nel 1951 ci fossero da 500.000 a 600.000 persone malate, con una prevalenza molto alta di 3-5 individui ogni 1.000 abitanti, compresa la capitale Pechino. Inoltre l’accesso alle cure risultava estremamente difficoltoso per la maggior parte dei pazienti, suggerendo che la VL li abbia uccisi a migliaia. La malattia era distribuita in 16 su 33 aree amministrative, a nord del fiume Yangzi, caratterizzate da 3 distinti profili ecologici:

• Il tipo principale, responsabile della maggior parte dei casi, era antroponotico, localizzato soprattutto nelle popolose pianure orientali lungo le vallate del fiume, la cui trasmissione venne presto interrotta;
• Zoonotico, associato alla presenza dei cani infetti, situato nelle aree montagnose del nordovest;
• Presunto zoonotico, ma senza serbatoi animali noti, all’estremità nordovest della regione desertica (fig. originale).

In queste aree diverse, la forza della trasmissione poteva essere stimata dall’età e dalla DTH (test di Montenegro). Così, nelle pianure, con la maggiore età media, similmente alla VL indiana, a differenza delle zone montagnose e desertiche, la maggior parte dei pazienti erano bambini piccoli, indicando una minore forza di trasmissione in queste zone pianeggianti. È interessante notare che nel deserto non venivano individuati cani infetti, mentre la maggior parte della popolazione presentava reattività al test di Montenegro (al contrario delle aree della zoonosi canina delle montagne), e questo suggerisce che la superiore pressione d’infezione nelle regioni zoonotiche rispetto alle pianure, non era dovuta alla presenza dei cani, ma fosse il risultato di un processo ancora poco compreso, probabilmente collegato alle preferenze alimentari del vettore.

In base all’ipotesi che l’antroponosi cinese fosse simile alla VL indiana causata da L. donovani e che la ZVL cinese avesse L. infantum come agente eziologico, venne condotta un’attenta analisi genotipica degli isolati di Leishmania nelle diverse regioni. Queste indagini sottolinearono l’eterogeneità degli isolati, ma dimostrarono che L. donovani predominava nelle pianure orientali e che L. infantum era concentrata nelle aree montuose di Pechino e Gansu, anche se alcuni isolati di L. infantum erano stati identificati nelle pianure ed alcuni di L. donovani provenivano anche dalle montagne, compreso uno da un cane. Nel deserto del nordovest vennero isolati ceppi di entrambe le specie. Così, anche se era stata dimostrata una corrispondenza tra ambiente e specie di Leishmania, era altresì dimostrata la coesistenza delle diverse specie in queste aree. Queste variabilità biologiche ed ecologiche hanno determinato enormi conseguenze sugli sforzi di controllo.

Subito dopo l’ascesa al potere dei comunisti nel 1949, vennero prese due misure maggiori per ridurre l’impatto della malattia, in un modo radicale che incarnasse lo spirito rivoluzionario: il trattamento in massa dei malati ed il controllo dei vettori. I laboratori cinesi iniziarono a produrre l’antimonio pentavalente, vennero istituite stazioni centrali anti-VL, ed oltre un migliaio di unità anti-VL, formate da personale specificamente addestrato, vennero formate in aiuto dei medici. Con questa organizzazione, 150-200.000 persone vennero trattate solo dal 1951 al ’53. Venne data un’altra priorità alla lotta contro i vettori, che iniziò nel ’51, con Phlebotomus chinensis che rappresentava un bersaglio facile, in quanto a quelle latitudini ha solamente una o due generazioni all’anno e rimane sui muri dopo essersi alimentato. Si iniziò a produrre gli insetticidi organoclorurati DDT e gammaesano e vennero condotti esperimenti che ne dimostrarono l’efficacia ed il prolungato effetto residuale. Il DDT venne utilizzato estensivamente fuori e dentro le abitazioni e negli annessi ed in tutte le case dei villaggi densamente popolati. Anche se sicuramente l’applicazione fu su larga scala, la precisa estensione del suo utilizzo nei critici anni ’50 non è conosciuta. A partire dagli anni ’80, il DDT ed il gammaesano non sono più stati utilizzati e sono stati sostituiti dai piretroidi, il cui utilizzo è oggi ristretto alle aree di ZVL.

Il programma d’eliminazione dei cani in Cina è anche più difficile da valutare dell’uso degli insetticidi, perché non si sa precisamente dove e con quale estensione sia stato applicato, probabilmente per l’ampia variabilità della prevalenza dell’infezione canina nel paese (da zero o poco più nelle pianure e nel deserto al 7% nelle aree montuose). Questa eterogeneità ha portato a diverse interpretazioni dell’efficacia della soppressione dei cani, in quanto alcuni autori hanno relegato il cuore del successo al trattamento massivo ed all’utilizzo estensivo degli insetticidi, mentre altri hanno attribuito un ruolo rilevante all’eliminazione dei cani nelle aree di ZVL. È importante rilevare che l’eliminazione dei cani non venne eseguita con metodi di selezione attendibili, ma uccidendo indiscriminatamente qualsiasi cane fosse trovato nelle aree endemiche. Per avere una minima idea dell’ampiezza di questo programma, è stato stimato che la soppressione sarebbe efficace solo se si eliminassero almeno i 3/4 di tutti i cani di un’area, a prescindere dall’evidenza della leishmaniosi. Comunque, anche se venne soppresso un numero enorme di cani, la trasmissione tra cani ricominciò 4 anni dopo.

Gli immensi sforzi fatti in Cina, furono premiati in maniera straordinaria, perché già dal 1958 la trasmissione fu interrotta del tutto nelle aree di leishmaniosi antroponotica, e questo divenne definitivamente una realtà negli anni ’70, insieme alla riduzione fino quasi all’estinzione di Phlebotomus chinensis dalle pianure, rendendo la leishmaniosi una malattia relativamente rara in Cina. L’incidenza annuale scese a 200-300 casi, limitati alle regioni montuose del nord e del nordovest, dove rimanevano le popolazioni esofile del vettore. Dopo l’iniziale successo, l’eliminazione completa della VL nel paese venne stimata a partire dagli anni ’60, ma negli anni ’80 si verificò un aumento del numero dei casi, attribuito allo smantellamento della rete anti-VL durante la Rivoluzione Culturale dal 1966 al 1976.

Non è facile speculare sull’efficacia del programma di controllo cinese, con tutte le sfumature che l’hanno caratterizzato. Una buona spiegazione del grande successo nelle pianure può essere la bassa pressione di trasmissione in queste aree e la densa popolazione, per cui il controllo fu evidentemente più agevole ed evidente. Invece, nelle zone del nordovest, l’alta forza dell’infezione ed una popolazione più dispersa, non permisero una simile brusca caduta dell’incidenza del numero dei casi. Si può imparare molto dalle differenze evidenti, tra il successo del controllo nelle aree antroponotiche e zoonotiche, rilevate nell’immane programma di controllo cinese. Ovviamente il controllo dell’antroponosi non può essere attribuito all’eliminazione dei cani, e questo porta alla conclusione che il controllo della trasmissione della leishmaniosi antroponotica in Cina può essere attribuito unicamente alla terapia di massa ed all’utilizzo del DDT e del gammaesano. La vera ragione del successo del controllo cinese della leishmaniosi antroponotica, appare essere stato l’uso dei pesticidi organoclorurati che eradicarono il Ph. chinensis, il vettore principale nelle pianure. Questa prima lezione dovrebbe rimanere. Ma resta la questione di quale possa essere stato l’effetto dell’eliminazione dei cani nelle aree zoonotiche. Oltre a due studi che hanno mostrato una riduzione del numero dei casi umani dopo l’eliminazione di massa dei cani ed il trattamento delle persone, l’uso simultaneo degli insetticidi organoclorurati nelle aree della ZVL impedisce ogni conclusione definitiva sull’efficacia relativa dell’eliminazione dei cani. Il mantenimento della trasmissione negli altopiani dimostra che l’uso degli insetticidi organoclorurati non ha avuto lo stesso successo nel controllo della ZVL come ha fatto con la forma antroponotica. Tuttavia, nonostante il successo generale del programma cinese, quello che i risultati indicano più chiaramente è come sia difficile controllare la ZVL.

Le esperienze delle strategie di controllo della leishmaniosi utilizzate nelle repubbliche transcaucasiche e dell’Asia Centrale dell’ex Unione Sovietica, sono utili in quanto forniscono informazioni molto attuali. In queste zone la malattia è causata unicamente da L. infantum e colpisce persone e cani. Era una malattia urbana, interessando città come Tblisi (Georgia), Yerevan (Armenia), Kyzylorda (Kazakistan), Tashkent e Samarcanda (Uzbekistan). I vettori erano Ph. chinensis, che è stato estinto, Ph. longiductus e Ph. sminov. Di particolare interesse è stata la situazione nell’oblast di Kyzylorda, dove la percentuale dei bambini malati al di sotto dei due anni di età raggiunse il 92,9%, mostrando una forza enorme dell’infezione, in modo simile alle regioni desertiche del nordovest della Cina.

Anche in questi paesi l’intervento è stato una combinazione di metodi tradizionali: l’individuazione ed il trattamento dei casi umani e l’eliminazione dei cani, ma il successo principale è stato raggiunto solo dopo l’uso del DDT per il trattamento delle abitazioni in un raggio di 500 metri dal microfocus e, in alcuni luoghi, anche a livello delle strade e degli isolati. Da quando queste misure sono state attuate, la leishmaniosi viscerale è diventata rara nell’area dell’Unione Sovietica, tranne che a Kyzylorda. In questa regione amministrativa, un’interruzione nella trasmissione si è verificata nella capitale, ma non c’è stata risposta alle azioni di controllo nelle campagne e nessuna riduzione del numero dei casi nella regione. Benché i cani risultino naturalmente infetti, è stato dimostrato anche un ciclo che coinvolge i coyote, e questo può aiutare a spiegare la difficoltà del controllo della malattia. Tuttavia la ragione principale del perdurare della trasmissione in questa oblast sembra sia stato lo scarso utilizzo del DDT, che successivamente è stato vietato in Unione Sovietica nel 1970. Il fallimento del controllo in quest’area indica che, come in Cina, l’interruzione della trasmissione nei focolai di L. infantum caratterizzati da un’elevata pressione di trasmissione, può rivelarsi impraticabile, anche con l’utilizzo del DDT.

L’esperienza del subcontinente indiano rivela l’impatto straordinario che il controllo della malaria col DDT ha avuto su quello della leishmaniosi. Nella regione indiana di Bihar, in Bangladesh ed in Nepal, la malattia ha presentato dei cicli epidemici fino alla fine degli anni ’40. Nel 1953 prese avvio il programma nazionale per il controllo della malaria tramite l’uso del DDT, che raggiunse l’apice nel 1958, portando alla scomparsa del vettore Ph. argentipes dall’interno delle case. Quindi la leishmaniosi subì una diminuzione notevole divenendo una malattia rara. Ma successivamente, con la fine della campagna globale di eradicazione della malaria nel 1971, la leishmaniosi è nuovamente esplosa, con il culmine nel 1977, colpendo circa 1 milione di persone, con un tasso di mortalità del 7% circa. Attualmente in India si sta implementando l’utilizzo del DDT nello stato di Bihar (dal 1971), ma senza avere raggiunto il controllo, anche se è stato previsto di eradicare la malattia nel 2015. Alcuni studi recenti hanno comparato l’efficacia dell’utilizzo di spray insetticidi con effetto residuale con le zanzariere impregnate di insetticidi e con le modificazioni ambientali, rilevando che i migliori risultati sono stati ottenuti tramite gli spray residuali utilizzati all’interno delle abitazioni. Un ulteriore studio ha comparato: a) nessun intervento; b) spray di insetticidi piretroidi; c) combinazione di insetticidi ed eliminazione dei cani sieropositivi, in tre distretti di Feira de Santana nello stato di Bahia (nordest del Brasile). Dopo 1 anno, l’incidenza della sieroconversione è risultata rispettivamente del 3,02, 2,86 e 1,65 ogni 100 bambini. Tale differenza non è risultata statisticamente significativa per distinguere gli effetti sulla trasmissione. Anche se tutti gli studi hanno presentato notevoli problemi, pare che sia emersa una tendenza dubbia, debole ed evanescente sulla protezione aggiuntiva conferita dall’eliminazione dei cani, ma molto meno di quanto stimato in teoria.

2.2. Nuovo Mondo

Nel Nuovo Mondo alcune esperienze fatte in Brasile sono importanti nella valutazione dell’efficacia dell’eliminazione dei cani infetti come misura di controllo. In questo paese la malattia è causata da L. chagasi (= L. infantum), con serbatoi vertebrati rappresentati da cani, volpi, altri mammiferi e persone, ed è trasmessa dal flebotomo Lutzomyia longipalpis che presenta abitudini sia esofile che endofile. È stata una malattia delle regioni semi-aride, in cui gli sforzi di controllo sono stati portati avanti a partire dagli anni ’50. Nonostante questo, sì è già registrata anche la trasmissione nelle città più piccole. L’attuale fenomeno dell’urbanizzazione su larga scala, iniziato nel 1981 quando l’epidemia colpì Teresina e Sao Luis nel centronord, si diffonde verso l’ovest ed il sud, colpendo molti stati, compresi Sao Paulo e Rio Grande do Sul, e le grandi città come Belo Horizonte e la capitale Brasilia (fig. originale). Inoltre il numero totale dei casi nel paese è quasi raddoppiato nonostante gli sforzi compiuti per il controllo. Il tasso d’incidenza cumulativo annuale è aumentato meno spiccatamente, ma il tasso di mortalità è aumentato significativamente, nonostante i progressi della medicina e lo sviluppo di linee guida specifiche per le più gravi forme della malattia. Recentemente sono iniziate delle epidemie urbane al confine con l’Argentina. La situazione della leishmaniosi in Brasile è l’opposto che in Cina, perché dopo quasi trent’anni di tentativi di controllo della patologia, il paese, che nel 1950 aveva quasi 10 volte meno casi della Cina, oggi ha quasi 10 volte più casi della Cina. Questa differenza è dovuta probabilmente al successo del controllo dei numerosi casi di VL antroponotica in Cina, mentre in Brasile si è tentato di controllare l’urbanizzazione emergente dando importanza all’eliminazione selettiva dei cani.

In Brasile il controllo della leishmaniosi iniziò nel 1953 nello stato di Ceará nel nordest semi-arido e, come in Cina ed Unione Sovietica, si fondava sul trattamento delle persone, l’utilizzo del DDT e l’eliminazione dei cani. Con la differenza che in Brasile venivano eliminati solo i cani con sierologia reattiva (sieropositivi). Nel 1953 venne soppresso un solo cane sierologicamente reattivo, ma nel ’54 e ’55 i casi arrivarono a 42 ed a 2000 nel 1960. Non è stata eseguita alcuna analisi sull’effetto della soppressione dei cani, ma in 14 contee in cui venne applicato il DDT, si verificò una riduzione dell’incidenza dei casi umani del 58,2% (da 765 a 320 casi), mentre in 14 municipi in cui venne praticata la sola soppressione dei cani, si registrò un incremento dell’11,9% (da 89 a 101 casi) (fig. originale). Sfortunatamente il DDT venne abbandonato negli anni ’60; il suo utilizzo si era rivelato in grado di ridurre l’incidenza della ZVL, anche se i risultati furono molto meno efficaci rispetto a quelli verificati per la forma antroponotica in Cina e India.

L’unica esperienza di controllo che ha rappresentato un successo a lungo termine in Brasile, si è realizzata alla fine degli anni ’60 nella vallata di Rio Doce dello stato di Minas Gerais, nella parte sudorientale del paese. Vennero applicate le misure classiche, tra cui il DDT, per circa 10 anni. Prima di allora risultava positivo fino al 40% dei cani. L’incidenza scese da 169 casi nel ’65 a zero nel ’78 e negli anni successivi. Ma nonostante la continuazione del programma – anche se con l’uso dei piretroidi al posto del DDT – l’infezione tra cani sta riemergendo. Un’altra esperienza di successo in Brasile si è realizzata in una piccola epidemia a Rio de Janeiro tra il ’79 e l’85, dove vennero utilizzati gli organoclorurati e poi i piretroidi; ma anche in questo caso non c’è stata interruzione della trasmissione.

L’applicazione delle misure di controllo su larga scala in Brasile, è seguita dopo le epidemie in seguito al processo di urbanizzazione ed espansione della malattia all’inizio degli anni ’80 nello stato di Piauí. Analogamente all’India, le azioni contro altre malattie ebbero delle ripercussioni sulla leishmaniosi, dal momento che l’utilizzo limitato del DDT pare avere avuto un certo effetto protettivo contro l’intensità della trasmissione della leishmaniosi (1981-’86). Nei municipi in cui venne utilizzato il gammaesano per il controllo della malattia di Chagas, si registrarono le più basse incidenze di leishmaniosi. Comunque il gammaesano non è mai stato usato per la leishmaniosi ed anche l’utilizzo del DDT all’interno delle abitazioni è stato minimo. È stato predominante l’utilizzo degli organofosforici e, successivamente, quello dei piretroidi a bassissimo volume. A parte le osservazioni degli anni ’50, non c’è mai stato alcuno studio controllato sull’utilizzo degli insetticidi per la leishmaniosi da L. chagasi nel Nuovo Mondo. Ciononostante il Brasile è l’unica nazione con un vasto programma d’eliminazione sistematica dei cani per il controllo della ZVL.

3. Importanza dell’infezione canina per la leishmaniosi viscerale umana

In letteratura non c’è mai stato accordo né sul ruolo dei cani nella trasmissione di L. infantum all’uomo, né sui benefici della soppressione dei cani. Comunque l’evidenza suggerisce che l’infezione nell’uomo e nel cane sono interdipendenti, anche se la trasmissione tra cani è stato ipotizzato che possa essere indipendente dalla presenza dei flebotomi (trasmissione transplacentare, con le trasfusioni e gli accoppiamenti) e non associata all’infezione umana. In genere si accetta la regola generale che dove si verifica la trasmissione di L. infantum tra le persone, si realizza anche tra i cani. In uno studio la più alta prevalenza dell’infezione nei cani non è risultata associata con una maggiore incidenza nell’uomo, ma in altri due studi in Brasile ed in un terzo in Iran, è stata rilevata questa associazione. Tali risultati discordanti dimostrano che l’associazione tra infezione umana e canina non è forte e suggeriscono che le infezioni nei due ospiti possono seguire dinamiche differenti, con un’interdipendenza più complessa di quanto si riteneva in passato. Per esempio, non può essere rifiutata l’esistenza di ospiti selvatici che trasmettono l’infezione sia all’uomo che al cane, come osservato in Asia Centrale. In Brasile questa fonte comune d’infezione può benissimo provenire dalle periferie delle città, come indicherebbe l’associazione tra la malattia umana e la vegetazione peri-urbana.

Un modo indiretto per analizzare l’interdipendenza tra l’infezione umana e canina è la valutazione della presenza dei cani come fattore di rischio per l’uomo. Ma anche così, i risultati continuano ad essere inconsistenti (tab./fig. originale). Cinque studi trasversali suggeriscono che i cani rappresentano un fattore di rischio. Due di questi lavori condotti nel Vecchio Mondo, mostrano che il numero dei cani ed il rapporto tra cani e persone aumentano il rischio di sieropositività nei bambini. Un altro studio, riguardante l’analisi multi-livello, ha dimostrato che la presenza dei cani può aumentare il rischio di manifestazioni cliniche, mentre un altro ha rilevato che la presenza dei cani (e del pollame) aumenta il rischio di sieroconversione. Un altro studio ha rilevato che il tempo che un cane resta in una casa aumenta il rischio di reattività cutanea a Leishmania. Tuttavia studi longitudinali hanno rivelato risultati borderline o dubbi. Due studi caso-controllo non hanno mostrato alcuna associazione significativa tra la presenza dei cani e la malattia tra gli uomini, sebbene il rischio di malattia sia risultato leggermente più alto tra i gruppi familiari che vivevano con i cani. Un altro studio di coorte ha mostrato un’associazione contraddittoria, a seconda che il risultato fosse valutato utilizzando la reazione cutanea o la sierologia; un altro ancora non ha rilevato alcuna associazione tra la presenza di cani e lo sviluppo della malattia nelle persone. Questi risultati piuttosto ambigui suggeriscono che gli studi in grado di misurare la percentuale del flusso dei parassiti dalla fonte canina all’uomo, devono ancora essere sviluppati. Per raggiungere questo obiettivo, è indispensabile condurre studi di coorte progettati appositamente.

Se da una parte è intuitivo pensare che i cani siano importanti serbatoi perché sono più competenti nell’infezione dei flebotomi rispetto alle persone, altri parametri che dipendono dai vettori (capacità vettoriale) sono molto più significativi per il basic reproductive number (capacità riproduttiva di base) della malattia (il numero di casi secondari che emergono da un caso d’infezione) e quindi per l’incriminazione dei serbatoi. Per esempio, alcuni modelli matematici ed osservazioni indicano che l’importanza di un serbatoio è regolata non solo dalla sua competenza nell’infettare il vettore, ma anche dai parametri che valutano il grado di esposizione degli ospiti vertebrati ai vettori e la mortalità giornaliera del vettore. Entrambi i parametri hanno un effetto non lineare, bensì quadratico ed esponenziale, sulla trasmissione della malattia. Questo significa che anche piccoli sforzi rivolti al controllo dei vettori, possono avere grossi risultati sulla trasmissione della malattia. Di contro, dal momento che la competenza dei serbatoi vertebrati nell’infettare i vettori ha un effetto puramente lineare sulla trasmissione, proporzionalmente sono necessari sforzi molto più grandi per controllare i serbatoi; ecco perché le strategie di eliminazione dei serbatoi sono meno efficaci del controllo dei vettori. In questo senso Dye e Burattini hanno stabilito un modello dell’impatto delle diverse strategie sulla trasmissione della leishmaniosi, dimostrando che l’eliminazione dei serbatoi vertebrati è molto meno efficace rispetto alla vaccinazione, agli interventi nutrizionali o all’uso degli insetticidi.

Queste incertezze teoriche hanno portato alla necessità di esami per valutare l’effetto dell’eliminazione dei cani sulla trasmissione della VL all’uomo. In Brasile sono stati condotti quattro studi di intervento (intervento = eliminazione dei cani) (tab./fig. originale). In qualche misura, tutti hanno valutato l’effetto dell’eliminazione selettiva dei cani sieroreattivi (sieropositivi). Per il primo di questi studi è stato fatto riferimento alla sieroconversione degli esseri umani, con l’indagine condotta in due aree rurali: non è stata rilevata alcuna differenza tra le aree d’intervento e controllo (20% vs 22% e 26% vs 27% rispettivamente) dopo un periodo di 6 mesi e di 1 anno. Il secondo studio ha comparato l’effetto di un programma d’eliminazione sull’incidenza dei casi pediatrici in due distretti urbani ed ha mostrato che l’incidenza annuale risultava più bassa nelle aree d’intervento che in quelle controllo (5/1000 vs 20/1000), ma, a causa di diversi fattori, gli autori non hanno potuto attribuire inequivocabilmente l’effetto protettivo all’eliminazione dei cani. Un altro studio ha ampliato la dimensione del campione ed ha utilizzato l’assegnazione casuale degli interventi ed un progetto fattoriale per valutare la sieroconversione. L’area di studio è stata rappresentata da 34 lotti di 200 x 200 m in un quartiere, e gli interventi sono stati realizzati in un area interna di 100 x 100 m, lasciando uno spazio di 200 m (buffer) tra ogni area d’intervento. In questo modo sono stati comparati i seguenti interventi addizionali, assegnandoli a caso: a) spray d’insetticidi negli annessi residenziali; b) eliminazione selettiva dei cani sieroreattivi; c) i due precedenti insieme; d) solo spray all’interno. Dopo 6 mesi fino ad 1 anno dall’intervento, l’incidenza nelle aree con eliminazione dei cani + spray all’interno (ma non all’esterno) è scesa dal 46% al 16,1%. Ma l’effetto dell’eliminazione dei cani è scomparso (dal 40% al 37,9%) nelle aree dove l’eliminazione dei cani è stata condotta insieme agli insetticidi interni ed esterni. Non si è verificata nessuna riduzione anche quando gli insetticidi sono stati utilizzati solo all’esterno. Il tre problemi principali in questo studio sono stati l’ampia proporzione delle aree buffer di non intervento (il 75% dell’area di studio), la perdita fino al 46% della popolazione studiata e la ripartizione del fondo dello spray interno, che ha ostacolato la valutazione degli effetti dell’eliminazione dei cani in mancanza dell’utilizzo degli insetticidi.

4. Conflitti tra scienza e programmi di controllo

Scienza e politiche pubbliche non sempre sono in accordo o vanno di pari passo. L’incorporazione delle conoscenze scientifiche nell’amministrazione pubblica dipende da questioni politiche, economiche ed etiche, dal grado delle evidenze scientifiche e dell’accordo tra scienziati ed anche da interessi corporativi dei responsabili delle decisioni. A causa del peggioramento della situazione della ZVL in Brasile e della mancanza di consenso scientifico, il bisogno della scelta della migliore politica sanitaria per il controllo della malattia è stato incline ad ignorare o travisare la scienza a disposizione. Inoltre la strategia della soppressione dei cani è ostacolata da diversi fattori, come la scarsa precisione dei metodi per valutare l’infettività dei cani, l’intensità degli sforzi necessari per rimuovere i cani, la sostituzione degli animali (con giovani a loro volta sensibili all’infezione) o il semplice rifiuto dei proprietari di consegnare le loro care ed affezionate creature. Viste queste difficoltà, la Pan American Health Organization (PAHO) ha commissionato una review (revisione) sistematica per la valutazione dei programmi di controllo della VL. La conclusione è stata che nonostante tutte le limitazioni, un numero rilevante di relazioni esaminate in dettaglio ha mostrato che non ci sono forti evidenze dell’impatto significativo sulla trasmissione della VL per nessuno degli interventi esaminati; la soppressione dei cani risulta l’intervento meno accettabile al livello della comunità per ovvie ragioni, ed ha bassa efficacia per via dell’alto tasso di sostituzione dei cani eliminati con cuccioli a loro volta sensibili all’infezione e per altri ostacoli culturali. Quest’ultima valutazione, nonostante le limitazioni degli studi analizzati, alla fine ha mostrato che l’ipotesi di Adler e Tchernomoretz non ha basi empiriche. La review è stata quindi presentata ad una commissione di consulenti come parte del Progetto per la costituzione di un’agenda di ricerca cooperativa regionale nel campo delle malattie trascurate, riunito dalla PAHO, dall’OMS (WHO), dal TDR e dal BiReMe, per un meeting, a cui hanno preso parte anche rappresentanti dei ministeri della salute dei paesi dell’America Latina endemici per leishmaniosi. Il meeting si è tenuto il 21 e 22 settembre 2009 a Foz do Iguaçu, Parana, Brasile, ed ha approvato le conclusioni della review sistematica: per i programmi di soppressione sistematica dei cani per controllare la VL manca l’evidenza scientifica che li metta in relazione alla protezione degli esseri umani.

Il giorno successivo, sempre a Foz do Iguaçu, è stato tenuto un altro meeting da parte dei capi dei programmi di controllo della VL del Cono del Sud (Meeting su sorveglianza, prevenzione e controllo della VL nel Cono del Sud dell’America Meridionale), in cui è stato deciso di raccomandare la soppressione dei cani infetti, presumibilmente col supporto del meeting precedente dell’agenda di ricerca, nonostante che un documento ufficiale non sia stato né scritto né approvato ed in chiaro contrasto con le conclusioni della review sistematica. Circa 10 giorni dopo la riunione della commissione della PAHO, il Ministero della salute brasiliano ha consultato un forum di esperti per valutare il divieto del trattamento dei cani, che era stato istituito dallo stesso ministero nel 2008. I membri del Forum hanno confermato il divieto, sempre in evidente disaccordo con le conclusioni della review sistematica. Il divieto è stato basato sulla considerazione che i cani infetti rappresentano la fonte di L. infantum per gli esseri umani e gli altri cani; inoltre, sempre secondo il Forum, qualsiasi trattamento non riesce a ridurre l’infettività e può anche favorire la farmacoresistenza ed ostacola la cooperazione della popolazione col programma d’eliminazione sistematica dei cani. La conferma del divieto rappresenta un provvedimento ancora più estremo dell’eliminazione sistematica in sé, perché preclude qualsiasi tentativo di recuperare gli animali infetti, identificati durante i controlli di routine e che i proprietari tentano di salvare, anche se mancano le evidenze scientifiche che la loro uccisione protegge le persone. Attualmente è in sviluppo una misura legale per rafforzare la politica dell’abbattimento degli animali sieropositivi, da parte del Ministero della salute brasiliano e l’Ufficio di consulenza legale brasiliano. Inoltre si possono prevedere misure ancora più estreme, sulla base dei recenti interessi sull’eliminazione dei cuccioli e dei canidi selvatici a rischio estinzione. È dunque evidente che il governo brasiliano non prenderà in considerazione le conclusioni della revisione sistematica.

Ci sono gravi problemi sulla validità delle conclusioni di questo forum sul trattamento dei cani consultato dal Ministero della salute brasiliano, in quanto non ha seguito le norme internazionali raccomandate per elaborare linee guida, incorrendo anche nei seguenti problemi:

• I partecipanti sono stati selezionati tramite criteri non pubblici;
• C’è stato un pregiudizio nella convocazione dei componenti, perché si sapeva già pubblicamente che gran parte dei partecipanti erano a favore della soppressione dei cani, e potenziali partecipanti contrari non sono stati invitati, portando ad opinioni pregiudizievoli;
• Tra i membri del forum non c’è stato nessun esperto di sviluppo di linee guida ed alcuni dei partecipanti non hanno esperienza nell’epidemiologia e nel controllo della leishmaniosi (anche se si tratta di scienziati illustri), e queste sono invece caratteristiche fondamentali per lo sviluppo di linee guida;
• Le decisioni non sono state precedute da una revisione sistematica, in quanto la scarsa letteratura consultata non seguiva le regole di questo tipo di valutazione d’evidenza, e l’unica review sistematica disponibile non è stata citata; il forum ha omesso pubblicazioni i cui risultati avrebbero potuto portare a conclusioni diverse.

Questo suggerisce che i partecipanti non hanno avuto accesso alla review sistematica ed a quanto avvenuto a Foz do Iguaçu, nonostante la presenza di membri del Ministero della salute e della PAHO ad entrambi i meeting. Per cui, non avendo utilizzato raccomandazioni internazionali per le review sistematiche e sviluppare linee guida, il caso del divieto del trattamento dei cani per il controllo della leishmaniosi in Brasile, ha messo in evidenza una perdita sistematica di neutralità scientifica nel raccomandare un provvedimento sanitario altamente discutibile.

Ci sono tante ragioni che possono portare ad ignorare la scienza orientata alla polita sanitaria, ed alcune di queste ragioni sembrano plausibili in questo caso. Una può essere la fragilità delle conoscenze sul controllo della leishmaniosi, come rilevato nella review sistematica. Un’altra è l’espansione territoriale della malattia e l’aumento dell’incidenza della mortalità, che generano aspettative e pressioni sui responsabili delle decisioni (il governo). Una terza ragione è la mancanza di alternative con effetto riconosciuto riguardo alla ZVL che, di fronte alle pressioni politiche, può spingere i responsabili delle decisioni ad assumere atteggiamenti irrazionali. Una quarta possibilità può essere il conflitto d’interessi. Anche senza considerare possibili lobby e gruppi di ricerca con interessi nel campo dei vaccini, dei test diagnostici, dei collari insetticidi e dei pesticidi, altri fattori non ben definiti, come le tradizioni o le raccomandazioni del passato sulle misure di controllo utilizzate in altri programmi, come per la rabbia, possono influenzare i decisori negativamente, portandoli a resistere ai cambiamenti nelle politiche di controllo della VL. Questo può essere dovuto alla percezione di minacce da parte delle innovazioni, perché i cambiamenti delle decisioni già prese possono essere interpretati come errori del passato e possono avere implicazioni in relazione al prestigio delle istituzioni ed all’interno delle stesse.

In Brasile sono in uso anche altre raccomandazioni ufficiali per l’elaborazione di ulteriori linee guida su altri aspetti delle leishmaniosi e su molte altre malattie tropicali, e sembrano confermare questa diffusa tendenza a distorcere le evidenze scientifiche. In ogni caso, probabilmente il fattore più importante che ha portato alla non conformità con le evidenze scientifiche sembra essere stato la mancanza di cultura istituzionale per la promozione dell’integrità scientifica. Questo sistema di valutazione delle prove scientifiche per le politiche pubbliche è disciplinato dalla promozione di revisioni sistematiche e dallo sviluppo e l’adozione di linee guida ufficiali. Se questo clima d’integrità fosse stato in uso, è improbabile che la scienza sarebbe stata così male interpretata. Infine, la perdita dell’integrità nell’interpretazione dei dati scientifici che si è verificata all’interno dello stesso Stato, è stata probabilmente facilitata dal fatto che la VL è una malattia trascurata che colpisce la parte della popolazione che ha meno voce, per la quale il controllo e la ricerca dipendono quasi del tutto dalla burocrazia statale.

5. Conclusioni

Oltre alle tre strategie utilizzate per il controllo della ZVL – il trattamento dei pazienti, gli insetticidi residuali all’interno delle abitazioni e la soppressione dei cani – sono state valutate anche altre strategie. In Iran è stato condotta una prova (trial) sul controllo tramite l’utilizzo di collari impregnati di deltametrina nei cani, in 9 villaggi-intervento comparati con 9 villaggi-controllo appaiati in base alla precedente sieropositività, con la valutazione dell’immunità dopo un anno d’osservazione. È stata osservata una riduzione dell’incidenza dell’infezione del 43%, valutata tramite la sierologia, ma la diminuzione dell’incidenza del DTH non è risultata significativa. In Sudan è stato testato un vaccino contro la leishmaniosi, formato da L. major autoclavata + BCG e comparato col solo BCG: la protezione si è realizzata solo nel 6%, ma il gruppo che iniziava a presentare la DTH era quello con la minore incidenza della malattia. Attualmente in India si sta valutando l’effetto delle reti impregnate di insetticida. Sono state pubblicate eccellenti revisioni sull’uso degli insetticidi e dei vaccini ed andrebbero consultate. Oltre ai metodi tradizionali per il controllo della leishmaniosi, ci sono alternative promettenti ed efficaci che possono allargare l’orizzonte della lotta contro questa malattia.

Dal momento che la ZVL attualmente rappresenta una minaccia anche in altri paesi del Sud America, la decisione su cosa fare in base alle conclusioni della revisione sistematica è diventata urgente ed imperativa. Dato che non vi è nessuna prova concreta su quanto i cani contribuiscano all’infezione umana o sugli effetti degli insetticidi, in particolare gli organoclorurati, e non ci sono analisi degli ostacoli operativi alle misure di controllo utilizzate su larga scala in ambienti urbani, e poiché gli eventi biologici, sociali o ecologici che hanno portato all’urbanizzazione ed alla diffusione della leishmaniosi sono assolutamente sconosciuti, devono essere una priorità gli investimenti nella ricerca che affronti questi problemi. La più immediata delle sfide sembra essere la ricerca di un vaccino che funzioni. Un recente simposio internazionale ha identificato le priorità per il progresso dello sviluppo dei vaccini, permettendo alle agenzie governative di sviluppare investimenti cruciali in questo settore (Gruppo di studio sulle priorità della ricerca per lo sviluppo di vaccini contro la leishmaniosi: “Vaccines for the Leishmaniases: Proposals for a Research Agenda” [HTML - PDF]). Come punto finale, la ripresa della crescita economica nelle economie emergenti in cui la VL è endemica, mette pressione su paesi come il Brasile, l’India e l’Iran, affinché si assumano le responsabilità della scienza e della tecnologia e per promuovere investimenti seri per lo sviluppo di vaccini di qualità adeguata per l’utilizzo nell’uomo. Nonostante le grandi controversie intorno all’uso del DDT, concernenti la tossicità e la persistenza ambientale, c’è un urgente bisogno di testare un suo possibile utilizzo per controllare la VL in ambiente urbano.

I paesi tropicali in via di sviluppo dovrebbero approfittare della lezione data dalla revisione sistematica sulle misure di controllo della leishmaniosi e le relative conseguenze politiche. Occorre ricercare le migliori conoscenze scientifiche disponibili, basate sulle migliori evidenze, per arrivare ai migliori programmi di sanità pubblica. Infatti, l’articolo 43 del Regolamento sanitario internazionale (International Health Regulations), di cui il Brasile e molti paesi endemici delle malattie trascurate sono firmatari, in una clausola, richiede prove scientifiche per lo sviluppo di politiche di sanità pubblica. Inoltre l’OMS, come molte altre organizzazioni, fornisce linee guida per lo sviluppo del consenso. Così lo stimolo per politiche volte a promuovere l’integrità, è un obiettivo facilmente raggiungibile ed è essenziale per la formazione di ambienti scientificamente neutrali. Pertanto la lezione della ZVL può essere utile per la verifica della qualità delle attuali raccomandazioni della sanità pubblica nei differenti paesi.

Il risveglio del movimento conservazionista e dei diritti delle minoranze, insieme con il riconoscimento di sentimenti complessi tra i mammiferi, ha notevolmente cambiato il rapporto morale tra esseri umani ed animali. All’interno di questo cambiamento nell’etica dei rapporti con gli altri esseri viventi, i cani appartengono a una delle specie più socievoli ed empatiche, e quindi non possono essere considerati come esseri moralmente irrilevanti che possono essere eliminati senza causare danni certi all’uomo. Pertanto i valori umani sempre più fini e sensibili implicano l’obbligo di giustificazioni scientifiche autorevoli e sicure, affinché siano moralmente valide, e questo non è mai avvenuto con qualsiasi programma per la soppressione dei cani per il controllo della leishmaniosi. Infine, qualcosa di buono può essere imparato dalle confuse conoscenze e decisioni del passato, dal momento che le migliaia di cani inutilmente sacrificati, potrebbero almeno servire a stimolare una rivoluzione in termini di qualità scientifica e nell’etica delle politiche sanitarie volte alle malattie trascurate.

Come ha affermato la Virbac™ in un comunicato stampa del 17.03.2011, il Comitato per i prodotti medicinali veterinari (CVMP) dell’Agenzia europea dei medicinali (EMA) il 13.01.2011 ha concesso parere positivo per la registrazione (e l’autorizzazione all’immissione in commercio) del vaccino CaniLeish^®, confermandolo definitivamente il 14.03.2011. Il 06.04.2011 l’EMA ha pubblicato i dettagli dell’autorizzazione: alla pagina sono disponibili alcuni documenti PDF che al momento rappresentano l’unica fonte d’informazione sul presidio (informazioni per il pubblico) e sulla documentazione presentata dalla ditta al CVMP, così come le motivazioni del parere favorevole dello stesso Comitato, contenute nel Public assessment report (Discussione scientifica, 04.04.2011, EMA/CVMP/296057/2010). Il documento, strutturato in parti standard in cui viene presentato e valutato il dossier della ditta richiedente, è composto dai seguenti capitoli: sintesi del fascicolo, certificazione di qualità, valutazione della sicurezza, valutazione dell’efficacia, valutazione rapporto beneficio/rischio. Si cerca di riassumere/tradurre le parti più importanti, integrandole, ove possibile e pertinente, con altre informazioni; la suddivisione semplificata in paragrafi e sottoparagrafi che faccio qui sotto non riflette precisamente quella del documento del CVMP in cui è facile perdersi.

1. Informazioni generali

Composizione del vaccino:

EMA: EMA/CVMP/296057/2010 - EPAR - Public assessment report, CaniLeish Scientific discussion (April 2011)

Quillaja saponaria

La ricerca, che ha avuto origine all’Institut de Recherche pour le Développement (IRD) (Montpellier, Francia), è stata incentrata sulle proteine escrete/secrete (ESP) di Leishmania (LiESAp). Queste proteine sono state identificate in diversi protozoi parassiti e sono caratterizzate da funzioni critiche durante il ciclo biologico del parassita (interazione con la cellula ospite, sviluppo intracellulare del parassita, modulazione della risposta immunitaria dell’ospite). È stato brevettato un terreno di coltura privo di siero. Questo terreno ben definito consente la crescita e il mantenimento di L. infantum essendo privo di cellule, siero, macromolecole (proteine ed acidi nucleici) e peptidi. Da questo terreno è stato isolato il surnatante con le ESP derivate dal parassita durante la crescita. Le sole proteine presenti nel terreno sono di origine parassitaria e presentano la loro conformazione nativa in quanto sono naturalmente escrete/secrete da Leishmania (1, 2). L’adiuvante utilizzato, estratti purificati di Quillaja saponaria, è stato scelto per le proprietà immunostimolanti, in quanto induce una forte risposta immunitaria di tipo 1 (Th1), mediata soprattutto dalle citochine IFN-, IL-2 e dall’attivazione dei linfociti T (LT) citotossici; questo tipo di risposta è ritenuto fondamentale per lo sviluppo di un vaccino efficace contro la leishmaniosi; la dose dell’adiuvante è stata stabilita sulla base di diversi studi preliminari sull’efficacia e la sicurezza (1).

2. Sicurezza

Per quanto riguarda le caratteristiche di sicurezza del vaccino, sono state valutate in due studi di laboratorio (in cani Beagle). Nel primo, i gruppi dei cani vaccinati e dei controlli erano rappresentati da soggetti di circa 4 mesi d’età (16-17 settimane), tutti sieronegativi (IFAT) all’inizio della prova. Il lotto del vaccino conteneva 120 microgr. di ESP/ml ed è stato inoculato SC in 4 dosi a distanza di 21 giorni; i soggetti sono stati esaminati (condizioni generali e locali del sito di inoculo) 4 ore dopo ogni dose e giornalmente per 14 giorni, e pesati una volta alla settimana a partire dal giorno (“D” da qui in poi) 7 fino alla fine del follow-up (D77). Sono stati considerati con ipertermia i soggetti con temperatura rettale superiore a 39,6 °C. Sono stati fatti prelievi di sangue – al D0, D3, D8 e una volta alla settimana fino al D77 – per le analisi ematologiche (emocromo). Nei cani vaccinati sono stati osservati solo segni leggeri e transitori (rigonfiamento e, in alcuni soggetti, noduli), che comparivano entro le prime 24 hh e si risolvevano entro 12 giorni di osservazione. Dopo la vaccinazione, in 2 soggetti su 10 è stata riscontrata una leggera e transitoria ipertermia. I due gruppi non hanno manifestato alcuna differenza statisticamente significativa per il peso corporeo ed i parametri ematologici. Tutti i cani sono rimasti sieronegativi (titolo < 80). Le conclusioni del CVMP sono che lo studio (4 vaccinazioni invece delle 3 raccomandate nello schema vaccinale, in cani più giovani dell'età minima raccomandata e con un sovradosaggio) ha dimostrato che la vaccinazione non determina gravi effetti collaterali. Nel secondo studio sono stati utilizzati cani e lotto vaccinale come nel precedente. Lo schema vaccinale ha previsto il sovradosaggio con 2 dosi di vaccino al D0 ed il follow-up è stato simile al precedente. I soggetti non hanno manifestato alcuna alterazione generale. Localmente invece il 70% dei vaccinati ha manifestato un rigonfiamento (diametro 2-7 cm) tra 4 hh dopo l'iniezione ed il D2 e che scompariva entro 5 giorni, ma non sono stati evidenziati né noduli né dolore; il 30% ha presentato una leggera ipertermia al D1 per 1 giorno (questi soggetti hanno presentato altri episodi leggeri e transitori d'ipertermia probabilmente a causa dell'agitazione) ma senza differenza statistica della temperatura tra i gruppi, così come per il peso corporeo ed i parametri ematici (nei limiti normali). Anche in questo caso tutti gli animali sono rimasti sieronegativi. Le conclusioni del CVMP sono analoghe al precedente (1). La valutazione della sicurezza è stata eseguita anche in uno studio di campo: cani di 51 razze diverse, di età superiore a 4 mesi, in 28 località francesi. Il vaccino è stato formulato a 110 microgr. di ESP/ml e sono state eseguite 3 inoculazioni a 3 settimane d'intervallo (D0, D21, D42); all'inclusione sono state eseguite analisi ematologiche e sierologiche (IFAT) seguiti poi da svariati controlli (fino al D56) generali e locali così come della temperatura e del peso (alcuni di questi controlli sono stati fatti dai proprietari a casa). Tutti i cuccioli hanno preso peso regolarmente durante tutto lo studio, a parte uno che però non ha presentato altri segni clinici generali; il peso medio degli adulti è rimasto stabile. Nei cani delle diverse razze il vaccino non ha indotto alcun effetto collaterale specifico diverso da quelli già osservati negli studi di sicurezza sui Beagle: reazioni locali come gonfiori, noduli, dolore alla palpazione o eritema, ipertermia, apatia e disturbi digestivi. Per quanto riguarda lo stato d'infezione da Leishmania all’inizio dello studio, quanto riportato dal CVMP non è molto chiaro: prima viene affermato che tutti i cani all’inclusione avevano un titolo IgG anti-Leishmania negativo ((1) pag. 17), e poi che al momento della prima iniezione circa il 15% dei cani era Leishmania-positivo ((1) pag. 18; non si capisce se e quanto tempo possa essere passato tra inclusione e prima iniezione o se si tratta di una positività diversa dalla sierologica, tipo alla PCR). Comunque la maggior parte di questi soggetti non ha presentato effetti collaterali; quelli che li hanno presentati non hanno subito conseguenze sostanzialmente diverse dai soggetti negativi. E questa sostanziale sicurezza è stata in seguito confermata anche negli studi d’efficacia di campo, con effetti che sono rimasti nel range accettabile per un vaccino canino (1).

Visto che il vaccino non è destinato all’uso in animali gravidi, non è stato condotto alcuno studio in questi cani (per cui il prodotto è da intendersi specificamente controindicato). Il processo produttivo ed i relativi controlli garantiscono l’assenza di microrganismi vivi nel prodotto finale. Per cui CaniLeish è considerato un vaccino inattivato in merito alla sicurezza di chi lo somministra ed all’impatto ambientale. Data dunque la natura del vaccino, sono possibili solo effetti collaterali dell’auto-inoculazione accidentale dell’adiuvante e non c’è motivo di considerarli diversi da quelli locali nei cani; tra l’altro le saponine vengono comunemente utilizzate in cosmetici e farmaci e del resto il rischio professionale in questo senso è remoto anche perché il vaccino verrà somministrato da parte dei medici veterinari (1).

3. Efficacia

Prima di entrare nel dettaglio della parte del dossier riguardante le prove di efficacia, il CVMP fa una lunga introduzione (che in questa sede è quasi interamente pleonastica), evidentemente in linea con la documentazione ricevuta dalla ditta richiedente. Un vaccino contro la leishmaniosi canina dovrebbe essere in grado di indurre un’immunità cellulomediata forte e di lunga durata. Durante tale risposta le cellule dendritiche dermiche migrano nei linfonodi tributari per presentare gli antigeni derivati da Leishmania ai linfociti T CD4 e CD8, i quali si accumulano nelle lesioni infiammatorie in via di sviluppo, promuovendo la distruzione del parassita, attraverso la produzione di citochine in grado di attivare la difesa macrofagica. La vaccinazione può promuovere tali risposte se gli antigeni vaccinali vengono somministrati in modo da attivare entrambe le sottopopolazioni linfocitarie. Un certo orientamento della risposta immunitaria è stato ampiamente implicato nell’evoluzione dell’infezione verso la progressione o la resistenza. La resistenza alla malattia sembra essere associata ad una risposta mista Th1/Th2 con la predominanza delle citochine Th1 (IFN-, TNF-, IL-2, IL-3, IL-12) e delle IgG2, mentre la malattia attiva è caratterizzata da una marcata risposta umorale. La vaccinazione in oggetto si basa sulla somministrazione di proteine alla base della risposta LT-dipendente. L’adiuvante è stato scelto perché in grado di intervenire in quest’orientamento della risposta immunitaria. La ditta richiedente ha scelto di focalizzare l’attenzione sui seguenti parametri: IgG, IgG1, IgG2 e risposta cellulomediata. Il postulato alla base della valutazione dell’efficacia del vaccino è che deve essere indotta una risposta mista Th1/Th2 per ottenere la protezione (1).

Nel dossier la dimostrazione dell’efficacia del vaccino si è basata su:

• Uno studio pilota su cani seguiti per circa 2 anni, con la valutazione dell’effetto protettivo della vaccinazione nei confronti dell’infezione attiva (che è diversa dalla semplice infezione, NdW) e della malattia;
• L’effetto protettivo della vaccinazione in seguito ad un tentativo d’infezione sperimentale, basandosi sulla valutazione della risposta immunitaria dei cani vaccinati e la rilevazione del parassita dopo la prova (studio sulla durata dell’immunità).

A supporto di questa dimostrazione, la ditta richiedente ha anche indagato la risposta Th1 dei cani vaccinati, in relazione ai parametri in vitro collegati alla risposta cellulare: attività leishmanicida dei macrofagi, saggio di proliferazione linfocitaria, IgG2 anti-ESP (1).

Considerando le difficoltà di riprodurre l’infezione e la malattia in laboratorio (i modelli sperimentali), su cui basare prove attendibili, i dati chiave per la dimostrazione dell’efficacia di questo vaccino si basano sulla prova di campo che ha interessato cani mantenuti in zone endemiche (studio in condizioni naturali) e seguiti nel corso di 2 anni. La scelta dello schema vaccinale del CaniLeish^® si è basata su quello dell’unico vaccino (Leishmune^®, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Brazil, NdW) che era in commercio (in Brasile) al momento della progettazione e dell’inizio degli studi. Inoltre tra le diverse preparazioni vaccinali provate di cui ci sono dati in letteratura, quelle che prevedono 3 iniezioni invece che 2, sono risultate più promettenti (1).

3.1. Studi di campo

L’efficacia del CaniLeish^® è stata testata in una prova d’esposizione naturale a L. infantum in 3 aree altamente endemiche del bacino del Mediterraneo: una in Italia (Napoli) e due in Spagna (Barcellona e Ibiza). I tre sotto-studi hanno seguito lo stesso piano: la fase della vaccinazione primaria in condizioni di laboratorio controllate e protette e la fase dell’esposizione naturale al parassita nelle aree ad alta endemia nel corso di 2 stagioni (di trasmissione) (1).

3.1.1. Efficacia di CaniLeish^® nei confronti dell’infezione naturale da Leishmania in Spagna e Italia

Nella prima fase della vaccinazione in laboratorio i cani sono stati mantenuti in condizione da prevenire ogni possibile contatto con Leishmania; nella seconda fase dell’esposizione naturale i cani (vaccinati e controlli) sono stati tenuti in canili all’aperto in aree endemiche. Si è trattato di uno studio multicentrico in cui sono stati inclusi Beagle provenienti da 3 canili ed esposti all’infezione naturale in 3 posti scelti in base alla situazione di endemia per leishmaniosi. I soggetti, controllati prima della vaccinazione in modo che fossero privi di anticorpi anti-Leishmania e di parassiti, avevano un’età da 5 a 9 mesi (6 mesi è l’età minima raccomandata per la vaccinazione). I cani sono stati assegnati a caso ai due gruppi dei vaccinati e dei controlli, tenendo in considerazione l’età, il peso e la cucciolata ((1): non si capisce in che senso, NdW), controllando che ne fosse rispettata l’omogeneità (1).

3.1.1.1. Fase della vaccinazione

• Animali: Beagle di 5-9 mesi, assegnati in numero uguale ad ogni sotto-studio (Napoli, Barcellona e Ibiza), sieronegativi per Leishmania ed Ehrlichia;
• Vaccino: lotti standard (110 microgr. di ESP) per la vaccinazione primaria e per i boost annuali;
• Schema vaccinale: in ciascun sotto-studio gli animali sono stati suddivisi in 23 vaccinati (3 iniezioni: D0, D21 e D42 + una boost 1 anno e 2 anni dopo la terza iniezione della vaccinazione primaria) e 22 controlli;
• Indagine: nel follow-up clinico è stata controllata la temperatura rettale e sono state quantificate le IgG1 e le IgG2 anti-ESP e -PSA (ELISA) al D0, D21, D42 e D56, le IgG anti-Leishmania (IFAT) al D0 e al D56;
• Risultati: in seguito alla vaccinazione non è stata osservata alcuna reazione generale dovuta al vaccino; in alcuni casi è stata osservata una reazione locale nel sito d’iniezione (un rigonfiamento talvolta associato ad arrossamento, dolore o crosta) che si è risolta spontaneamente entro qualche giorno. I cani erano privi di Ac contro le proteine vaccinali e l’intero parassita prima dell’inizio dello schema vaccinale; tutti i controlli lo sono rimasti. La fase della vaccinazione primaria ha indotto una risposta immune analoga nei 3 sotto-studi: una risposta mista IgG1/IgG2 contro ESP ed una prevalente risposta IgG2 contro PSA. I cani hanno anche sviluppato IgG contro l’intero parassita (IFAT) ed è stata osservata anche una risposta cellulare specifica (la linfoproliferazione e la produzione di IFN- sono aumentate significativamente nei gruppi vaccinati) (1).

3.1.1.2. Fase dell’esposizione naturale

• Esposizione naturale: un mese dopo l’ultima iniezione vaccinale (M0) i cani sono stati trasferiti in canili nelle aree endemiche per essere esposti al flebotomo vettore; tutti i soggetti sono risultati negativi alla PCR ed alla coltura (M0);
• Indagine: nel corso di 2 anni è stato valutato: IgG1 e IgG2 anti-ESP (ELISA) – M0, M3, M9, M11, M12, M18, M23, M24 – e l’immunità cellulare e, in due luoghi, anche l’attivazione dei linfociti T. L’entità dell’esposizione a Leishmania è stata valutata tramite:
  • PCR nested (nPCR) e PCR real-time (rtPCR) su midollo osseo (M0, M9, M12, M15, M18, M21, M24, M25) ed isolamento in coltura da aspirati midollari o linfonodali (M0, M9, M15, M18, M21, M24);
  • Visite cliniche per valutare eventuali segni compatibili con leishmaniosi;
  • IFAT omologhi ed eterologhi per valutare i livelli di IgG anti-Leishmania (M0, M3, M6, M9, M11, M12, M15, M18, M21, M23, M24);
  • Analisi ematologiche e biochimiche (emocromo e rapporto albumina/globuline [M0, M3, M9, M12, M15, M18, M21, M24]);
  • Valutazione del punteggio clinico (il documento non è molto chiaro) in due categorie: soggetti con punteggio < o uguale a 3 e quelli con punteggio >3, assegnando 1 per ogni alterazione emato-biochimica (come leucopenia, anemia e/o trombocitopenia, iperproteinemia e/o iperglobulinemia) ed ogni segno clinico (come alterazioni cutanee, linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni oculari, artrite);
• Altri dati: 9 cani sono stati persi per cause estranee alla vaccinazione o alla leishmaniosi. Per cui sono stati valutati 65 vaccinati e 61 controlli;
• Significatività statistica: p < o uguale a 0,05;
• Considerazioni: negli studi la valutazione dei vari biomarker (proliferazione in vitro dei LT, produzione di IFN-, attività macrofagica di killing associata alla produzione di ossido nitrico [NO], risposta delle IgG [totali,1 e 2], DTH [LST]) ha rivelato un profilo immunologico costante e riproducibile nei cani vaccinati, ovvero: una prevalente risposta IgG2 anti-PSA, una risposta mista IgG1/IgG2 anti-ESP, un aumento dell’attività leishmanicida macrofagica ed uno specifico miglioramento della linfoproliferazione e della produzione di IFN-. Ma il CVMP riporta anche che non è stato possibile identificare un profilo immunologico diverso nei cani vaccinati che hanno sviluppato l’infezione persistente rispetto a quelli resistenti (1).

La definizione dello stato dei cani nei confronti della leishmaniosi (o dell’infezione) è un punto fondamentale per l’interpretazione dei dati d’efficacia e la valutazione dell’efficacia del vaccino. La ditta richiedente ha fornito una spiegazione dei dati ed una definizione aggiornata per lo stato dei cani esposti alla malattia (o all’infezione):

EMA: EMA/CVMP/296057/2010 - EPAR - Public assessment report, CaniLeish Scientific discussion (April 2011)

La classificazione proposta è stata considerata accettabile anche perché è descritta in letteratura (1, 4). I dati degli studi di campo confermano che un cane che come alterazione ha la sola PCR positiva (infezione subclinica) può andare incontro a negativizzazione, mentre se e quando l’infezione diventa attiva, il sistema immunitario non è più in grado di opporsi alla moltiplicazione attiva del parassita e lo stato del soggetto passa dalla fase asintomatica ad un periodo più o meno lungo di malattia sintomatica (1).

3.1.1.2.1. Tassi d’esposizione

Il tasso d’esposizione è stato stimato dalla percentuale dei controlli positivi a Leishmania almeno una volta:

• Napoli: 89%;
• Barcellona: 55%;
• Ibiza: 14%.

Tassi d’esposizione importanti sono stati ottenuti a Napoli e Barcellona, mentre a Ibiza è stato rilevato un tasso molto basso e questo può essere dovuto a diversi motivi: condizioni climatiche avverse al vettore, calendario di studio (i cani sono stati trasferiti nel luogo, nella prima stagione, più tardi rispetto a quando previsto), utilizzo di insetticidi ed acaricidi ambientali e topici. Questo sito è stato considerato differente ed i dati di Ibiza sono stati esclusi dall’analisi finale dei risultati (1).

3.1.1.2.2. Risultati

• Considerando i siti di Napoli e Barcellona, approssimativamente il 57% dei cani vaccinati ed il 72% dei controlli sono risultati positivi a Leishmania almeno una volta durante lo studio; per cui approssimativamente il 43% dei vaccinati ed il 28% dei controlli sono rimasti negativi durante l’intera fase dell’esposizione naturale;
• Follow-up della carica parassitaria: è stata comparata l’evoluzione della carica parassitaria tramite la rtPCR. Quando un cane è morto, l’ultimo valore di carica disponibile è stato riportato fino a M24:
  • È stato osservato un aumento della carica parassitaria media in entrambi i gruppi da M9 alla fine dello studio;
  • I valori medi sono risultati significativamente più alti nel gruppo controllo che in quello dei vaccinati in tutto il periodo;
• È stata osservata una maggiore probabilità di diventare infetti nei controlli che nei vaccinati (differenza significativa: p=0,0265);
• È stata osservata una maggiore probabilità di diventare sintomatici nei controlli che nei vaccinati (differenza significativa: p=0,0466). Le manifestazioni cliniche più gravi sono state osservate principalmente nel gruppo controllo, in cui l’evoluzione della malattia ha richiesto l’eutanasia di alcuni cani per ragioni etiche ed ha portato alla morte spontanea di un soggetto. Anche per un cane vaccinato è stata necessaria l’eutanasia;
• La percentuale dei cani dichiarati infetti alla fine dello studio (M24) è risultata significativamente differente tra i gruppi (superiore nei controlli: p=0,0254); stesso riscontro per la percentuale dei cani sintomatici;
• La percentuale dei cani dichiarati sintomatici alla fine dello studio (M24) è risultata significativamente più alta nei controlli che nei vaccinati (differenza significativa: p=0,0455);
• È stato osservato che i vaccinati che diventavano infetti e mostravano manifestazioni cliniche, non trovavano alcun giovamento dalla continuazione della vaccinazione.

Odds-Ratio infezione attiva

3.1.1.2.3. Conclusioni

In definitiva questo rappresenta lo studio chiave della richiesta (della ditta) ed ha dimostrato il beneficio della vaccinazione, secondo lo schema raccomandato (3 somministrazioni come vaccinazione primaria ed 1 boost annuale) seguendo i cani per 24 mesi, nel ridurre il numero dei cani che sviluppano un’infezione attiva e la probabilità di sviluppare i segni clinici nei cani vaccinati. Ciò convalida lo schema vaccinale ed in particolare l’iniezione boost dopo 1 anno. È stato osservato che il contatto col parassita ad Ibiza è risultato basso (1 controllo ha sviluppato la forma sintomatica portando ad eutanasia e un vaccinato ha sviluppato la forma asintomatica). Conseguentemente non è possibile arrivare ad una conclusione chiara per quanto riguarda l’efficacia del vaccino a Ibiza, per via del contesto epidemiologico specifico dello studio di campo, per cui tale efficacia è risultata più difficile da valutare. Questo può essere collegato all’alto numero di animali richiesto per dimostrare il beneficio della vaccinazione nelle zone con bassa prevalenza (1).

3.1.2. Studio sull’efficacia clinica del vaccino CaniLeish^® in aree endemiche

Si è trattato di uno studio aperto multicentrico eseguito per valutare l’efficacia del vaccino (110 microgr. di ESP), utilizzato secondo il protocollo della vaccinazione primaria (3 vaccinazioni a 3 settimane di distanza), in aree endemiche per leishmaniosi canina. Sono stati inclusi cani di varie razze, d’età da 5,5 mesi a 12 anni al D0, distribuiti in 23 località francesi e 12 italiane; i dati di 221 soggetti sono stati interpretati per l’analisi d’efficacia. Ad ogni vaccinazione i soggetti sono stati visitati per evidenziare eventuali effetti collaterali riconducibili alla vaccinazione. Analisi: all’inclusione analisi ematologiche e sierologiche e PCR su midollo; 2 settimane dopo l’ultima iniezione: IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA vaccinali e IgG anti-Leishmania. I risultati sierologici sono stati valutati secondo due criteri: suddivisione dei soggetti per età (giovani di circa 6 mesi 26,7%, adulti 73,3%) e la sieropositività per Leishmania al D0 (90% negativi, 10% positivi) (1).

Effetti collaterali sono stati registrati nel 28% dei cani, e la maggior parte consistevano in reazioni nel sito d’iniezione (edemi, granulomi, dolore), in alcuni casi anche segni generali (letargia, ipertermia) o di natura allergica (edemi allergici, reazioni anafilattiche). L’analisi statistica dei dati sierologici non ha evidenziato differenze significative tra gruppi qualunque fosse lo stato per Leishmania (positivi o negativi). Inoltre successivamente un altro studio ha eseguito un’analisi esplorativa sui dati immunologici cumulativi degli studi d’efficacia del vaccino, stabilendo che la sierologia, qualunque fosse l’isotipo o l’antigene (ESP o PSA), non è risultata sufficientemente correlata con la protezione (1).

3.2. Studi di laboratorio

Questi studi sono intesi a valutare l’inizio e la durata dell’immunità.

3.2.1. Inizio dell’immunità (IdI)

Nel primo studio presentato sono stati inclusi Beagle di 6 mesi sieronegativi per Leishmania; metà ha ricevuto le 3 iniezioni di base (100 microgr. di ESP) e l’altra metà è stata utilizzata come controllo. Tre settimane dopo l’ultima iniezione (D63) è stato eseguito il DTH test per valutare la risposta T, e sono state eseguite le analisi (ematologiche e delle sottopopolazioni linfocitarie al D0, D14, D21, D42, D63 e D70), della risposta umorale (ELISA IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA, IgG anti-Leishmania al D0, D21, D42, D56 e D70) e cellulare (CMLA al D0, D63 e D70). Tutti gli animali sono rimasti in buona salute ed hanno preso peso regolarmente ed i parametri ematologici sono rimasti entro i limiti normali senza differenze significative tra i due gruppi. Al D70 non c’è stata una chiara evidenza di alcun effetto dell’iniezione degli antigeni di Leishmania sul conteggio delle sottopopolazioni linfocitarie e dei parametri ematologici. Tre settimane dopo la vaccinazione primaria, il vaccino ha indotto una risposta mista Th1/Th2, evidenziata dalla prevalente risposta IgG2 anti-PSA, dalla risposta mista IgG1/IgG2 anti-ESP e dall’aumento della CMLA (testimone della capacità dei macrofagi di uccidere il parassita). È stata osservata anche la positività al DTH test nella maggior parte dei cani vaccinati (correlata in letteratura con la resistenza all’infezione).

È pacifico che la ditta richiedente ha condotto tutti i test immunologici più importanti in accordo con le attuali conoscenze e letteratura; tutti i dati hanno messo in evidenza la complessità della risposta del sistema immunitario all’infezione da Leishmania. Anche se sono stati indagati molti parametri, non è stato possibile definire alcuno specifico marker o profilo che si correlasse con la protezione o l’infezione, come stabilito dall’analisi esplorativa dei dati immunologici cumulativi (presentati nel prosieguo).

È particolarmente difficile definire l’IdI per via della lentezza dello stabilirsi (il CVMP parla di “installation“, NdW) dell’infezione, e quindi della malattia, dal momento dell’inoculazione iniziale all’inizio della patologia (periodo d’incubazione). A causa della mancanza di correlazione tra biomarker e protezione, l’IdI non può essere stabilito da questo studio. Comunque l’IdI può essere definito sulla base dello studio di campo chiave (3.1.1) come l’intervallo di tempo tra la terza iniezione e l’inizio della fase d’esposizione, cioè quando i cani sono stati trasferiti nei siti d’infestazione durante la stagione dei flebotomi a Napoli e Barcellona; visto che la differenza è di 22 e 27 giorni, la ditta richiedente ha proposto di fissare l’IdI a 4 settimane, che il CVMP ha ritenuto accettabile (1).

Nel secondo studio sono stati inclusi cani di 6 mesi (sieronegativi per ESP, PSA ed intero parassita) suddivisi in 10 vaccinati (vaccinazione di base con 100 microgr./ml di ESP + 60 microgr. QA-21) e 10 controlli. Nel follow-up sono stati valutati la temperatura rettale ed il peso; sono stati eseguiti prelievi di sangue per valutare la risposta immunitaria umorale (IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA al D0, D21, D42 e D56 e l’IFAT per gli anticorpi anti-Leishmania al D0 e D56) e cellulare (CMLA al D0 e D62, test di linfoproliferazione ed il test IFN-ELISpot al D62). Tutti gli animali sono rimasti in buona salute ed hanno preso peso regolarmente e non sono state osservate reazioni generali né episodi di ipertermia dopo la vaccinazione. Tre settimane dopo la terza iniezione vaccinale, i linfociti T hanno acquisito la capacità di proliferare e di produrre IFN- in risposta all’antigene di Leishmania per promuovere la distruzione dei parassiti attraverso l’attivazione macrofagica. La fase vaccinale di questo studio ed il relativo follow-up di molti parametri immunologici ha dimostrato una risposta mista IgG1/IgG2 contro le proteine vaccinali (ESP) ed una predominante risposta IgG2 anti-PSA; tale risposta è correlata con l’immunità cellulare come mostrato dall’aumento della CMLA e dall’attivazione dei LT. Questi dati sono risultati comparabili ed omogenei a/con quelli dello studio d’efficacia precedente. Ma l’interpretazione dei risultati di questa fase dello studio è stata difficile perché non è stato stabilito il valore protettivo dei suddetti parametri.

Nella fase successiva, tre settimane dopo l’ultima vaccinazione (D63/W0), i cani hanno subito un’inoculazione endovenosa di uno stipite virulento di L. infantum (ITMAP-263 a 108 promastigoti per cane). Il follow-up dei successivi 20 mesi è stato volto a rilevare l’eventuale infezione (PCR e coltura midollari) ed i vari parametri immunologici ed ematobiochimici, ma non è stato possibile rilevare alcun segno clinico chiaramente riconducibile alla leishmaniosi e tra i gruppi dei vaccinati e dei controlli non è emersa alcuna differenza dei parametri ematobiochimici (follow-up clinico e paraclinico). L’inoculazione dello stipite virulento ha indotto un’infezione debole e tardiva dal momento che è stata rilevata (PCR e coltura) solo in 4 cani su 10 in ciascun gruppo, 9 mesi dopo la prova, che non è stata in grado di indurre la malattia con espressione clinica dell’infezione. La risposta immune contro le ESP indotta dalla vaccinazione primaria è diminuita o scomparsa, mentre l’immunità cellulare T è perdurata, ma l’infezione sperimentale non è stata sufficientemente virulenta da permettere di stabilire la protezione conferita dal vaccino. L’indagine è stata estesa oltre un anno in quanto la prima rilevazione dell’infezione si è verificata 9 mesi dopo l’inoculazione, ma nonostante questo lungo periodo, il tasso d’infezione è rimasto troppo basso per valutare l’efficacia del vaccino, e l’inoculazione sperimentale non si è rivelata sufficientemente virulenta da permettere di determinare l’IdI. Come riportato più volte in letteratura, è assai difficile stabilire un valido modello d’infezione/malattia sperimentale, infatti si trovano dati discordanti e sostanzialmente inconcludenti (metodi eterogenei e non riproducibili); questo può essere dovuto all’impossibilità di replicare in laboratorio le condizioni naturali di campo e l’enorme variabilità dell’esposizione dei cani ai flebotomi (infetti e non infetti). Comunque per ragioni etiche e perché erano già disponibili i dati dello studio di campo (lo studio chiave), la ditta richiedente ha deciso non ripetere la prova sperimentale.

Tuttavia è stato osservato che anche nel gruppo dei vaccinati alcuni cani sono risultati infetti ed hanno sviluppato un’infezione persistente; la vaccinazione di questi cani non ne ha permesso la protezione contro l’infezione, anche se la risposta immunitaria di questi soggetti dopo la vaccinazione è risultata simile a quella dei cani protetti. Inoltre è stato osservato che i cani infetti persistentemente, sia controlli che vaccinati, presentano IgG2 anti-ESP dopo l’inoculazione sperimentale, al contrario dei cani resistenti, mentre il postulato di partenza era che le IgG2 rappresentano i parametri della risposta immunologica protettiva Th1. Anche se ci sono alcune indicazioni per un trend, da questo studio non è stato possibile trarre conclusioni chiare sulla possibile correlazione tra la risposta immunologica e l’evoluzione dell’infezione (1).

3.2.2. Durata dell’immunità (DdI)

In un primo studio sono stati inclusi Beagle sieronegativi di 5-7 mesi, equamente divisi tra vaccinati (100 microgr./ml di ESP, vaccinazione primaria) e controlli e seguiti da W0 a W61 per quanto riguarda il peso, i parametri ematologici, l’immunità umorale (ELISA IgG1/IgG2 anti-ESP e -PSA e IFAT IgG anti-Leishmania) e cellulare (sottopopolazioni di LT e CMLA). Tutti gli animali sono rimasti in buona salute ed hanno preso peso regolarmente ed i parametri ematologici sono rimasti normali senza differenza tra i due gruppi. Un anno dopo l’ultima iniezione (W58) è stato eseguito un DTH test su ogni animale di ciascun gruppo, per valutare la risposta immunologica cellulomediata T specifica: i cani di entrambi i gruppi hanno mostrato reazioni locali dopo l’iniezione degli antigeni di Leishmania, con una risposta DTH che è comparsa prima ed è risultata significativamente più intensa nei vaccinati che nei controlli (segno di un’immunità cellulare specifica contro gli antigeni di Leishmania nei vaccinati). L’osservazione di un boost della risposta umorale nei cani vaccinati ha indicato la presenza di una memoria immunologica generata dalla vaccinazione primaria: tre settimane dopo l’iniezione di leishmanina (W61) il 70% dei vaccinati ha presentato di nuovo titoli IgG1 anti-ESP, il 90% IgG2 anti-ESP, il 50% IgG2 anti-PSA ed il 90% IgG anti-Leishmania, mentre nessun boost di IgG1 anti-PSA. Il vaccino ha indotto un IdI umorale e cellulare 3 settimane dopo la vaccinazione, definito dalla risposta anticorpale mista IgG1/IgG2 anti-ESP ed IgG2 anti-PSA che sono durate meno di 6 mesi, e da un aumento della CMLA che è continuata per 1 anno. Il DTH test eseguito un anno dopo la vaccinazione primaria ha dimostrato la presenza di una risposta immune cellulomediata di memoria testimoniata dalla positività al test e dal boost della risposta umorale.

Il CVMP conclude che questo studio ha rilevato l’assenza della persistenza degli anticorpi dopo la vaccinazione, qualsiasi fosse la loro natura, ed un effetto boost in seguito al contatto con l’antigene di Leishmania; mentre è stata osservata una risposta cellulare persistente. Nell’interpretazione di questo studio sorgono problemi interpretativi per via del valore dei parametri indagati e la loro potenziale correlazione con l’efficacia della vaccinazione: i risultati hanno confermato la presenza di un’immunità di memoria rivelata dal DTH test nella maggior parte dei cani, ma da questo studio non può essere fatta alcuna affermazione sulla DdI (1).

In un secondo studio sono stati utilizzati Beagle di 6 mesi come nel precedente (suddivisione in gruppi e protocollo vaccinale). Il follow-up è stato analogo al precedente ed è durato 12 mesi dalla vaccinazione primaria. Un anno dopo l’ultima iniezione vaccinale (nuovaW0) è stata eseguita un’infezione sperimentale endovenosa con un ceppo virulento di L. infantum. Dopo 47 settimane è iniziata e si è sviluppata l’infezione (rtPCR e coltura midollari) ed il follow-up ha previsto diverse valutazioni a cadenza settimanale dei parametri clinici ed ematobiochimici, dell’immunità umorale (solite IgG1 e IgG2 contro gli antigeni vaccinali e IgG anti-Leishmania), cellulomediata (CMLA, IFN-ELISpot) ed il monitoraggio del sistema antiossidante del glutatione (GSH). Tra i due gruppi non è stata rilevata differenza dei parametri ematologici, mentre per quanto riguarda la CMLA è leggermente aumentata nei controlli a W32 così come il valore medio nei vaccinati in seguito al challenge (l’infezione sperimentale) ed è rimasta significativamente più alta che nei controlli. La produzione media di IFN- è aumentata a W32 dopo il challenge in entrambi i gruppi, ma di più nei vaccinati (non significativamente a W32, significativamente a W47). Nella maggior parte dei controlli è stato registrato uno squilibrio della GSH reduttasi, mentre il rapporto nei vaccinati è rimasto stabile per tutta la durata dello studio.

Per lo stato d’infezione e l’immunità umorale riporto la tabella come sul documento del CVMP:

EMA: EMA/CVMP/296057/2010 - EPAR - Public assessment report, CaniLeish Scientific discussion (April 2011)

Le conclusioni del CVMP sono che nonostante la diminuzione dei cani che sviluppano l’infezione persistente nel gruppo dei vaccinati (30% contro il 70% nel gruppo controllo), questo studio non permette di trarre conclusioni sull’efficacia del vaccino né sulla DdI, in quanto l’analisi statistica non permette di stabilire differenze statisticamente significative tra di due gruppi, probabilmente a causa del numero (esiguo?, NdW) degli animali inseriti nello studio. Comunque la DdI è sostenuta anche dallo studio di campo che ha dimostrato il beneficio della vaccinazione secondo lo schema vaccinale raccomandato (3 somministrazioni come vaccinazione primaria ed 1 booster annuale). Il challenge non ha indotto una malattia clinica e la prima infezione è stata identificata 15 settimane dopo (sia nei controlli che nei vaccinati). Tuttavia è stato osservato che nel gruppo dei vaccinati c’è stato un più alto numero di cani che ha controllato l’infezione (infezione mai rilevata) o l’hanno bloccata (infezione rilevata ma progressivamente bloccata) durante le 47 settimane di follow-up dopo il challenge. Comunque questo challenge è risultato più efficace nell’indurre l’infezione, di quello dello studio sull’IdI.

Considerando la carica parassitaria a livello individuale (comparazione dei dati dei cani infetti, vaccinati o controlli), la vaccinazione non ha permesso di diminuire la carica nei cani vaccinati infetti in comparazione con i controlli. L’analisi dei dati individuali ha mostrato che l’utilizzo dei parametri sierologici o dell’immunità cellulare per descrivere e predire lo stato futuro del cane nei confronti dell’infezione non è chiaro ed evidente (1).

Una sieroconversione di entrambi le risposte umorali (IgG anti-Leishmania ed IgG2 anti-ESP) è stata osservata solo nei controlli infetti permanentemente, e quindi questa sieroconversione è stata correlata con l’infezione in questi cani. Al contrario i controlli che hanno bloccato l’infezione non hanno sieroconvertito.

Secondo il CVMP questi risultati sottolineano ancora le difficoltà di definire un profilo protettivo immunologico post-infezione. Per diagnosticare l’infezione sono state usate la PCR e la coltura su midollo osseo ed è stata osservata una buona correlazione tra i risultati di queste due indagini: a W47, il 20% dei controlli ed il 70% dei vaccinati è risultato non infetto, mentre l’80% dei controlli ed il 30% dei vaccinati ha presentato un’infezione asintomatica.

Nell’insieme questo studio, anche se non definitivamente conclusivo (a causa della mancanza della significatività statistica), ha confermato un effetto benefico del vaccino 1 anno dopo l’infezione per ridurre lo sviluppo di un’infezione persistente durante le 47 settimane seguite al challenge, e supporta i dati ottenuti nello studio di campo. Conseguentemente una DdI di 1 anno dopo la ri-vaccinazione è stata accettata dal CVMP (1).

3.2.3. Conclusione generale sugli studi di laboratorio

Dopo la vaccinazione è stata osservata una risposta costante ed omogenea negli studi di laboratorio per i seguenti parametri:

• Risposta umorale: risposta mista IgG1/IgG2 anti-ESP e predominante IgG2 anti-PSA; questa risposta umorale non è persistita nel tempo ma ha subito un boost in seguito ad un nuovo contatto con l’antigene un anno dopo la vaccinazione primaria;
• Risposta cellulare: in tutti i cani vaccinati è stata osservata una risposta omogenea e persistente, sulla base dei test della linfoproliferazione, della CMLA e del DTH.

Sono stati eseguiti due challenge (tentativi d’infezione sperimentale per via endovenosa): il primo (per stabilire l’inizio dell’immunità), eseguito 3 settimane dopo la vaccinazione, ha indotto un’infezione debole e tardiva sia nei controlli che nei vaccinati, e lo studio non ha permesso di arrivare ad alcuna conclusione sull’efficacia del vaccino; il secondo challenge (per stabilire la durata dell’immunità), eseguito un anno dopo la vaccinazione, ha dimostrato una riduzione del numero degli animali infetti nel gruppo dei vaccinati. I dati di laboratorio sono stati considerati solamente come supporto per avvalorare le conclusioni dello studio di campo (1).

3.2.4. Studi generali

La ditta richiedente ha condotto un’analisi dei dati cumulativi degli studi d’efficacia per determinare se il profilo immunologico indotto dalla vaccinazione si correla con la protezione o la resistenza alla malattia. Ma il CVMP ribadisce che questi dati sono insufficienti per validare qualsiasi biomarker (1).

È stato eseguito un altro studio per valutare possibili interferenze tra gli anticorpi indotti dalla vaccinazione e metodi diagnostici diversi: sono stati utilizzati cani di 5-6 mesi divisi in due gruppi; a 10 è stata fatta la vaccinazione primaria e 2 sono stati lasciati come controlli. I soggetti sono stati seguiti clinicamente e ne è stata valutata la risposta immunologica (i due isotipi di IgG contro le proteine vaccinali) e sono stati eseguiti dei test diagnostici comuni: tre diversi metodi IFAT (che utilizzano isolati di Leishmania sia omologhi che eterologhi rispetto al vaccino) e tre diversi test rapidi commerciali (che utilizzano antigeni di Leishmania purificati). Non sono stati notati effetti collaterali legati al vaccino e tutti gli animali sono rimasti in buona salute. Prima dell’inizio della vaccinazione tutti i soggetti sono risultati sieronegativi sia per gli isotipi contro le proteine vaccinali (ESP e PSA) sia per le IgG anti-Leishmania, ed i controlli lo sono rimasti per tutto lo studio. Dopo la vaccinazione, tutti i cani hanno presentato una buona risposta immunologica nei confronti del vaccino: i tassi di sieroconversione per le IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA sono risultati in conformità ai dati ottenuti negli studi precedenti. La risposta umorale anti-Leishmania infantum valutata con i tre metodi IFAT è stata diversa in base all’isolato di Leishmania utilizzato: due settimane dopo la terza iniezione vaccinale (D56) il 100% dei cani ha risposto nei confronti dell’isolato omologo utilizzato nei laboratori Virbac™ ed anche nei confronti di un isolato eterologo (questa risposta è diminuita rapidamente, e 4 mesi dopo la terza iniezione vaccinale i titoli sono risultati bassi); il 70% dei cani ha risposto nei confronti di un altro isolato eterologo (anche questi anticorpi sono diminuiti rapidamente e solo il 30% degli animali è rimasto positivo 2 mesi dopo la terza iniezione vaccinale). Invece tutti e tre i test rapidi hanno dato esito negativo dopo la vaccinazione e fino alla fine dello studio. Dunque questo studio ha dimostrato che la risposta umorale (anticorpi IgG) diretta contro parassiti interi di L. infantum in seguito alla vaccinazione, interferisce con i test IFA eseguiti in laboratori di referenza che utilizzano isolati di L. infantum sia omologhi che eterologhi, mentre non interferisce con alcuni test rapidi ambulatoriali, che quindi, secondo quanto riportato dal CVMP, possono essere utilizzati per distinguere gli anticorpi vaccinali da quelli indotti dall’infezione naturale (1).

3.3 Conclusioni generali sull’efficacia

Gli studi presentati nel dossier hanno confermato la difficoltà di valutare l’efficacia di un vaccino contro una malattia parassitaria caratterizzata da un’evoluzione e da manifestazioni eterogenee. La dimostrazione dell’efficacia del vaccino è stata basata su uno studio di campo della durata di due anni, che ha coinvolto cani vaccinati e controlli, esposti naturalmente all’infezione in zone ad alta endemia. Dopo questi due anni, il vaccino ha dimostrato di ridurre il numero dei cani che sviluppano un’infezione attiva nel gruppo dei vaccinati e, dal punto di vista del singolo cane, di ridurre significativamente la probabilità di infettarsi e di sviluppare la malattia. In condizioni di debole pressione infettiva, non è stato possibile individuare un beneficio chiaro derivante dalla vaccinazione.

Gli studi di laboratorio hanno fornito informazioni limitate, nonostante l’esecuzione di molte indagini biologiche come la valutazione dell’immunità umorale (IgG1 e IgG2 contro gli antigeni vaccinali e IgG totali) e cellulare: non è stato possibile definire in maniera netta alcun biomarker o profilo immunologico che fosse associato alla protezione dall’infezione. Tuttavia i dati delle prove sperimentali hanno mostrato che l’infezione può essere rilevata da 4 a 9 mesi dopo l’infezione sperimentale e che la vaccinazione determina una risposta costante ed omogenea. Comunque tale risposta non può essere collegata in maniera chiara alla protezione e alla risposta futura dei cani all’infezione.

Considerando la diversità dell’evoluzione dell’infezione ed il periodo d’incubazione variabile (che può essere anche di diversi mesi), è risultato difficile definire per questo vaccino i tempi quali l’inizio e la durata dell’immunità e della protezione negli studi di laboratorio, ma una durata dell’immunità di un anno dopo l’ultima ri-vaccinazione ed un inizio dell’immunità di 4 settimane, sono stati supportati dai dati di campo (1).

4. Valutazione beneficio/rischio

La valutazione del dossier presentato dalla ditta richiedente ha tenuto conto che questo vaccino è destinato ad un mercato limitato, e sono state implementate alcune riduzioni nei dati normalmente richiesti dal CVMP per l’autorizzazione dei vaccini secondo le linee guida sui dati richiesti per i prodotti veterinari immunologici per usi e specie minori (5).

CaniLeish^® è il primo vaccino ad essere autorizzato per la profilassi contro l’infezione da Leishmania infantum in Europa. In considerazione della diffusione dell’infezione, della sua natura zoonotica e della difficoltà della terapia, benché i risultati sull’efficacia non abbiano mostrato la protezione completa dei cani vaccinati, si può concludere che la vaccinazione contro la leishmaniosi possa rappresentare un’alternativa valida e/o complementare ai mezzi che già sono a disposizione (terapeutici e profilattici). Anche se la protezione completa contro la leishmaniosi o l’eradicazione della malattia non sono possibili, questo vaccino è in grado di ridurre il rischio di sviluppare l’infezione attiva e la malattia a livello individuale, e di concorrere a diminuire l’incidenza della malattia al livello della popolazione canina. Inoltre, benché l’impatto epidemiologico globale non possa essere stimato dai dati del dossier, ci si può aspettare che, in relazione alla leishmaniosi, il miglioramento della situazione nel cane potrà avere un impatto positivo anche sulla salute umana. Infine nessun rischio grave è stato associato alla vaccinazione, neanche nei cani già infetti.

Secondo il CVMP il rapporto beneficio/rischio è a favore del primo e quindi del vaccino e quindi della concessione dell’autorizzazione.

5. Aggiornamenti

5.1. Filmato del prof. Gaetano Oliva sul vaccino

In un altro filmato in inglese afferma che probabilmente in Italia arriverà all’inizio del 2012. Ricordo che Oliva è stato uno dei protagonisti degli studi italiani sul vaccino.

Toxoplasma gondii

I parassiti devono impegnare le proprie forze per completare il ciclo biologico a scapito di ospiti che mettono in pratica una serie di auto-difese. Il meccanismo è importante soprattutto per quei parassiti nel cui ciclo c’è un ospite vettore che è in stretto contatto con – o viene mangiato da – un organismo bersaglio specifico in cui il parassita continua il ciclo. Il parassita ed il suo ospite si devono trovare nel posto giusto al momento giusto affinché avvenga la trasmissione al successivo ospite idoneo. Questo, in alcune situazioni, ha portato la selezione naturale a favorire i parassiti in grado di manipolare il comportamento dei propri ospiti.

I parassiti possono utilizzare sostanze chimiche od altri mezzi per alterare i comportamenti degli ospiti in modo da trarne benefici, aumentando le possibilità di trasmissione all’ospite successivo. Possono verificarsi dei cambiamenti nel fenotipo dell’ospite, come l’acquisizione di nuovi comportamenti, che forniscono una forte evidenza del concetto di fenotipo esteso, cioè di geni di un organismo che hanno un’espressione fenotipica in un altro organismo.

Esempi classici di “manipolazione” parassitaria

La letteratura scientifica presenta molti casi di comportamenti modificati degli animali parassitati. Gli spinarelli (piccoli pesci) che ospitano la forma larvale del cestode Schistocephalus solidus, nuotano più vicini alla superficie dell’acqua e sono meno impauriti dalla presenza degli uccelli predatori che fungono da ospiti definitivi (OD). I roditori infestati dal nematode Trichinella spiralis o dal protozoo Sarcocystis cernae manifestano comportamenti d’allerta meno pronunciati nei confronti dei predatori, facilitando la trasmissione del parassita agli OD.

In alcuni casi si osservano comportamenti completamente nuovi negli ospiti infestati. Per esempio, un ragno tessitore infestato dalla larva di una vespa parassita, costruisce una ragnatela diversa dal solito per proteggere la larva emergente dopo la morte del ragno stesso. Un’altra vespa parassita induce il suo ospite, un bruco, a restare vicino al parassita dopo che lo stesso è emerso dal suo corpo, proteggendo le pupe da potenziali predatori, agendo come una sorta di guardia del corpo. Le formiche infestate da un nematode che deve essere trasmesso ad uccelli frugivori, non solo diventano simili a frutti sviluppando un addome rigonfio e rossastro, ma si comportano anche come frutti, rimanendo appesi tra gli altri frutti di colore simile, con l’addome in posizione rialzata ed immobile, in attesa degli uccelli predatori. Le larve di alcuni nematodi mermitidi sono parassite e si sviluppano in ospiti artropodi, ma devono raggiungere l’ambiente acquatico in cui i vermi adulti vivono dopo la maturazione. Inducono il loro ospite artropode a suicidarsi portandolo a cercare l’acqua ed a tuffarcisi. Anche in questo caso la manipolazione coinvolge l’improvvisa comparsa di nuovi comportamenti dell’ospite indotti dal parassita a proprio vantaggio.

È evidente che molti parassiti sono in grado di manipolare il comportamento del loro ospite in natura. Ed anche gli animali domestici possono essere infestati da parassiti manipolatori sia come ospiti bersaglio che come vettori manipolati. La rabbia è uno degli esempi migliori di un patogeno che altera il comportamento dell’ospite. Il Rhabdovirus infetta il SNC dei mammiferi (in particolare le regioni del cervello che controllano i comportamenti sociali e di aggressività) e le ghiandole salivari. L’ospite infetto può manifestare aggressività che facilita la trasmissione del virus attraverso il morso. Anche se l’esito fatale della rabbia costringe l’agente patogeno a cercare continuamente nuovi ospiti, i cambiamenti comportamentali indotti dal virus assicurano la trasmissione, la sopravvivenza e la diffusione del patogeno nel tempo, nello spazio e tra specie con un’efficienza davvero straordinaria.

Parassiti di interesse veterinario

Dicrocoelium dendriticum

Dicrocoelium dendriticum

Il trematode D. dentriticum (due ospiti intermedi [OI] ed un OD) ha una diffusione mondiale (Europa, Asia, Nord Africa ed America). Anche se la patogenicitià generalmente è bassa, la dicroceliosi può portare a dimagrimento e riduzione della produzione di latte nei ruminanti domestici (OD) e, talvolta, può essere mortale. Attualmente stanno aumentando le segnalazioni della malattia, soprattutto a causa dello sviluppo di resistenza nei confronti degli antielmintici ed a causa della diffusione del parassita stesso. D. dendriticum è trasmesso ai ruminanti, comprese vacche e pecore domestiche, quando si cibano accidentalemente di formiche parassitate (dalle metacercarie) attaccate alle erbe. Le larve del parassita inducono i loro insetti ospiti a salire in cima agli steli d’erba ed a restarci ancorati tramite le mandibole (in cui inducono una paralisi spastica, dovuta al fatto che 1-2 metacercarie, invece d’incistarsi, restano avvolte da una membrana idrofila sensibile alle variazioni di luce e temperatura, in prossimità del ganglio nervoso retrofaringeo; nelle ore più fresche della giornata la membrana si dilata e comprime il centro nervoso), in attesa dell’ingestione da parte di un erbivoro al pascolo.

Diplostomum spathaceum

Cataratta da Diplostomum spathaceum

Il comune verme piatto (trematode) oculare D. spathaceum ha un ciclo biologico a 3 ospiti che comprendono lumache limneidi, pesci ed uccelli che si cibano di pesci, come i cormorani. Le cercarie che nuotano liberamente, prodotte tramite moltiplicazione asessuata nella lumaca e liberate nell’acqua, devono trovare un pesce in cui penetrare attraverso le branchie o la pelle. Migrano nei tessuti fino al cristallino dell’occhio in cui si sviluppano in metacercarie. Il ciclo viene completato quando il pesce ospite viene mangiato, insieme alle metacercarie, dall’ospite definitivo (uccello). Localizzandosi negli occhi dell’ospite, le metacercarie causano la cataratta per via della distruzione meccanica del cristallino e dei prodotti metabolici escreti dai parassiti, riducendo la vista dell’ospite. L’infestazione da D. spathaceum nel pesce è associata anche a modificazioni del comportamento dell’ospite, come l’aumento dell’attività, la migrazione verso la superficie dell’acqua e la diminuzione della responsività agli stimoli visivi, mentre la capacità di nuotare non viene alterata. In questo modo, lesionando importanti organi di senso, D. spathaceum è in grado di alterare i meccanismi antipredatori fondamentali del pesce, in modo da aumentare la vulnerabilità dell’OI nei confronti di quello definitivo. D. spathaceum è un parassita cosmopolita che infesta parecchie specie di pesci, con alte prevalenze ed intensità in certi ospiti. Anche se gli effetti patologici della diplostomiasi vengono documentati raramente nei pesci selvatici, in parte perché gli individui con alte cariche parassitarie vengono rimossi dalla popolazione tramite la predazione, le epizoozie da D. spathaceum possono raggiungere livelli molto gravi nei pesci in cattività, soprattutto negli allevamenti di salmonidi come la trota arcobaleno (Oncorhynchus mykiss). Dal momento che le cercarie di D. spathaceum non cercano attivamente l’ospite e spesso sono distribuite casualmente, il comportamento di evitare questa fonte d’infestazione è il meccanismo primario di difesa mostrato dal pesce ospite. Come risultato dell’esposizione elevata e continua alle larve parassitarie, D. spathaceum frequentemente viene ritrovato abbondantemente nei pesci d’allevamento e può causare seri problemi sanitari. Segnalazioni aneddotiche riportano che le trote arcobaleno gravemente infestate da D. spathaceum non rispondono alle esche da pesca, riducendone l’utilizzabilità nella pesca sportiva.

Echinococcus

Echinococcus granulosus

L’echinococcosi è causata dall’infestazione da cisti (metacestodi) del cestode Echinococcus. Questi parassiti hanno un ciclo biologico a due ospiti mammiferi. L’OD è un carnivoro in cui i cestodi adulti albergano nel piccolo intestino. Le uova sono eliminate con le feci e vengono ingerite accidentalmente dall’OI, in cui schiudono e si sviluppano in cisti idatidee nei polmoni, nel fegato ed in altri organi interni. L’OD s’infesta nel momento della predazione di quello intermedio. Attualmente si conoscono molte specie di Echinococcus, anche se ci sono numerosi stipiti genetici intraspecifici. Echinococcus ha un ristretto range di OD, costituito soprattutto da canidi domestici e selvatici, ma ha una distribuzione cosmopolita, essendo virtualmente presente in tutti i continenti. I metacestodi sono generalmente meno ospite-specifici delle tenie, potendo sviluppare in molti erbivori ed onnivori, come uomo, pecora, bovino e cavallo.

E. granulosus ed E. multilocularis sono le specie più importanti per le implicazioni di salute pubblica e per la distribuzione geografica. E. granulosus infesta principalmente gli animali domestici, avendo il cane come OD e la pecora come OI, ma può infestare anche l’uomo. E. granulosus ed E. multilocularis sono responsabili dell’echinococcosi cistica ed alveolare rispettivamente; entrambi determinano, tramite riproduzione asessuata, la formazione di un numero crescente di cisti che possono causare debilitazione ed anche risultare letali. Tra l’altro gli OI possono risultare più vulnerabili ai predatori, tra cui gli OD del parassita. L’ipotesi che l’echinococcosi possa aumentare la vulnerabilità ai predatori deriva dalla segnalazione aneddotica di Crisler (1956) secondo cui un caribù (Rangifer tarandus) non riuscì a fuggire dai lupi. La necroscopia rivelò che i polmoni erano infestati da un numero notevole di cisti di E. granulosus. Analogamente le alci (Alces alces) possono presentare infestazioni polmonari massive che determinano una resistenza inferiore degli animali allorché cercano di sottrarsi alla caccia dei lupi (Canis lupus), OD di E. granulosus. Lupi ed altri carnivori predano selettivamente gli animali più deboli e le alci con idatidosi possono risultare più vulnerabili alla predazione. Ciononostante nessuno studio ha mai dimostrato empiricamente un legame diretto tra l’infestazione idatidea, l’aumento del rischio di predazione ed i tassi superiori di trasmissione del parassita. Gli organi interni come i polmoni sono tra i primi ad essere mangiati da parte dei grossi carnivori come i lupi. Pertanto è probabile che la selezione naturale abbia favorito la localizzazione delle cisti parassitarie in questi siti per garantire un rapido consumo da parte dell’ospite definitivo piuttosto che assicurare la probabilità della trasmissione. Comunque sia è evidente l’effetto patologico dell’echinococcosi di modificare il comportamento di fuga dell’OI in modo di aumentarne la predazione e conseguentemente la trasmissione del parassita.

E. multilocularis è un parassita formidabile, perché la forma larvale stabilisce nell’OI una serie di complessi meccanismi che, se da una parte ne promuovono lo sviluppo e la diffusione, dall’altra si estrinsecano con alterazioni patologiche limitate, consentendo una sopravvivenza prolungata dell’ospite e quindi del parassita stesso. Questi meccanismi coinvolgono le interrelazioni tra molecole di superficie e prodotti metabolici del parassita da una parte ed il sistema immunitario (soprattutto la componente cellulo-mediata) dell’ospite dall’altra. Infatti è stato dimostrato che nei roditori di laboratorio con immunità cellulare deficiente e nei pazienti umani HIV positivi, l’infestazione non segue il normale corso in equilibrio, ma assume forme più gravi e potenzialmente fatali. E si può speculare che questo possa dipendere da una perturbazione dei meccanismi evolutivi che hanno portato il metabolismo del parassita ad adattarsi alle difese dei suoi ospiti, e quindi non può reagire altrettanto bene quando si trova in un ambiente immunitario alterato.

Toxoplasma gondii

Tachizoite di Toxoplasma gondii

Le alterazioni comportamentali dell’ospite in seguito all’infestazione parassitaria, talvolta si manifestano proprio come se l’ospite agisse a vantaggio del parassita impegnandosi alla sua trasmissione. Questo è tipico delle modificazioni comportamentali indotte da T. gondii nel suo ospite, influenzando la trasmissione all’OD. T. gondii è un protozoo intracellulare cosmopolita in grado d’infettare tutti i vertebrati endotermi. Il parassita ha un ciclo biologico complesso in cui i felidi – soprattutto il gatto – rappresentano gli OD. Le oocisti che raggiungono l’ambiente con le feci dell’ospite sono resistenti, potendo restare infettanti per più di un anno. Durante questo tempo debbono essere ingerite da un altro ospite, che può essere rappresentato da un altro gatto (in cui il parassita invade le cellule intestinali, matura e poi produce sessualmente nuove oocisti) o da un OI.

Benché possano essere infettati molti organismi endotermi (roditori, uccelli, uomini), i roditori selvatici rappresentano gli OI naturali di T. gondii. Nella fase acuta dell’infezione il parassita penetra nell’intestino, va incontro ad un processo di riproduzione asessuata ed entra nei macrofagi attraverso i quali viene trasportato nei siti d’elezione per l’incistamento. Quindi il parassita dà origine a cisti resistenti in diversi organi del proprio ospite intermedio, soprattutto a livello del cervello; queste cisti possono persistere per tutta la vita dell’ospite infetto. Il parassita completa il proprio ciclo allorché un gatto si ciba dei tessuti incistati. Anche se la sopravvivenza di T. gondii non è strettamente dipendente dal proprio OD e può essere mantenuto nel tempo nelle popolazioni di OI tramite la trasmissione congenita, il cannibalismo o la predazione interspecifica, la sua infettività aumenta dopo ogni episodio di riproduzione sessuata. Dal momento che questa si verifica solo nell’OD, il parassita in definitiva è dipendente dalla predazione degli animali infetti da parte del gatto. Conseguentemente ci può essere una forte pressione selettiva per la trasmissione all’OD e dunque per lo sviluppo da parte del parassita di meccanismi che promuovono la trasmissibilità dagli OI ai gatti.

La toxoplasmosi latente è stata a lungo considerata un’infezione inapparente in ospiti immunocompetenti. Ma studi recenti hanno dimostrato che l’infezione cronica da T. gondii può indurre alterazioni comportamentali degli ospiti infetti. Nei roditori il parassita determina un aumento dei livelli d’attività ed una diminuzione della neofobia (paura delle novità) e dell’ansia; caratteristiche che potenzialmente possono aumentare la possibilità della trasmissione agli OD. Dato che T. gondii preferenzialmente invade e si incista nel cervello dei propri OI, le alterazioni comportamentali (aumento dell’attività e perdita della neofobia) osservate nei ratti selvatici infetti, originariamente sono state attribuite all’encefalite. Ma altri parassiti cerebrali a trasmissione diretta (la cui trasmissione non dipende dalla predazione dell’ospite) dei ratti selvatici sembra non inducano modificazioni del comportamento. I ratti sono fortemente neofobici e mostrano un’innata reazione d’avversione all’odore di gatto, anche dopo diverse centinaia di generazioni senza esposizione al predatore. Una tale tendenza anti-predatoria è un chiaro ostacolo alla trasmissione di T. gondii e può rappresentare un bersaglio primario per la manipolazione parassitaria. I ratti infetti non solo perdono la naturale avversione all’odore di gatto, ma addirittura pare che ne siano specificamente attratti, anche se altre caratteristiche comportamentali (come l’atteggiamento sociale e riproduttivo) restano inalterate.

Anche se ci sono studi che forniscono prove convincenti sulla capacità di T. gondii di alterare il comportamento dei propri OI, due questioni fondamentali sono ancora senza risposta. In primo luogo, i tassi effettivi di predazione dell’OD nei confronti dei ratti infetti e non infetti in natura attualmente sono sconosciuti e richiedono ulteriori ricerche. Testare il legame reale tra la manipolazione dell’ospite e l’aumento della trasmissione (cioè l’aumento della predazione) in condizioni naturali, è la base delle ipotesi sulla manipolazione. In secondo luogo, non sono ancora chiariti i meccanismi attraverso i quali T. gondii colpisce il SNC dell’ospite e riesce ad alterarlo nei modi descritti. Gli effetti dannosi della toxoplasmosi latente nell’uomo comprendono la meningoencefalite, i cambiamenti di personalità, la diminuzione del quoziente intellettivo, la riduzione delle prestazioni psicomotorie ed i disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia. È probabile che, per indurre le alterazioni comportamentali, siano necessarie la secrezione di sostanze chimiche e/o l’alterazione della produzione di neurotrasmettitori da parte di T. gondii, dal momento che il solo effetto fisico della presenza delle cisti nel cervello, è improbabile che sia sufficiente a determinare tali complesse e specifiche alterazioni dei comportamenti innati dell’OI. Negli ospiti infetti si registrano cambiamenti dell’espressione dei recettori cerebrali dopaminergici ed ansiogeni, dei livelli di neurotrasmettitori (come la dopamina) e delle concentrazioni di noradrenalina e testosterone.

Anche se gli effetti della toxoplasmosi sul cervello sono stati investigati a fondo, le vie attraverso cui T. gondii altera il comportamento dell’ospite, restano poco chiare. Per esempio, l’invasione preferenziale di diversi siti cerebrali da parte di ceppi differenti di T. gondii può influenzare la gravità della patologia. Inoltre il decorso dell’infezione è strettamente dipendente dalle caratteristiche sia del parassita che dell’ospite; nell’uomo e nei roditori di laboratorio, diverse linee genetiche di T. gondii possono manifestare differenze di virulenza. Per comprendere a fondo i meccanismi attraverso cui il parassita riesce ad indurre le alterazioni comportamentali, è essenziale una combinazione di studi neurochimici e comportamentali, che tengano presente sia l’ospite che i ceppi genetici parassitari.

Conclusioni

Da quando van Dobben (1952) riportò che pesci ospiti delle larve del cestode Ligula intestinalis erano significativamente più soggetti ad essere catturati dai cormorani (OD) rispetto ai pesci non infestati, è stato sospettato che i parassiti possano manipolare i propri ospiti. Da allora sono stati documentati diversi esempi di modificazioni indotte dai parassiti in parecchie associazioni ospite-parassita, tra cui anche specie d’importanza medica e veterinaria. Alcune patologie, come la rabbia e l’echinococcosi, destano particolare preoccupazione a causa della recente riemergenza, l’ampia distribuzione spaziale e le implicazioni per la salute pubblica. Le alterazioni indotte dai parassiti sono state spesso considerate manipolazioni parassitarie adattative che aumentano i tassi di trasmissione degli agenti patogeni. Tuttavia i meccanismi, in particolare dal punto di vista neurologico, alla base di queste alterazioni comportamentali, solo di recente hanno iniziato ad essere delucidati. Argomento centrale resta il modo in cui un patogeno possa alterare il fenotipo del proprio ospite. Capire tali meccanismi è vitale per rispondere a domande evoluzionistiche fondamentali. Senza dimenticare che la comprensione delle strategie parassitarie di trasmissione rappresenta la base per gli aspetti applicati della parassitologia, ovvero la terapia delle patologie associate. L’utilizzo della proteomica per studiare le proteine prodotte dai parassiti manipolatori e le alterazioni comportamentali dell’ospite, offre nuove prospettive per lo studio della manipolazione parassitaria. Gli studi futuri certamente trarranno beneficio dall’attenzione alle interrelazioni molecolari (soprattutto per i meccanismi neurochimici) tra gli ospiti ed i propri parassiti manipolatori.

Riferimenti:

1. Lagrue C., Poulin R. – Manipulative parasites in the world of veterinary science: implications for epidemiology and pathology – Vet J. 2010;183(3):9-13 [abstract];
2. Puccini V. – Guida alle malattie parassitarie degli animali domestici (3^a ed.) – Edagricole, 1992;
3. Crisler L. – Observations of wolves hunting caribou – J Mammalogy 1956;37:337-46;
4. Dubey J.P. – Toxoplasmosis of animals and humans (2^nd ed.) – CRC Press, 2010;
5. van Dobben W.H. – The food of the cormorant in the Netherlands – Ardea 1952;40:1-63;
6. Mejri N., Hemphill A., Gottstein B. – Triggering and modulation of the host-parasite interplay by Echinococcus multilocularis: a review – Parasitology. 2010;137(3):557-68 [abstract].

L’esplosione dei concetti dell’EBM ha portato troppo spesso alla pubblicazione di lavori (sia libri che singoli articoli) in cui viene data esclusiva importanza a quello che risulta dalla letteratura, tralasciando un minimo di integrazione con le esperienze più valide della pratica quotidiana. In realtà, nel corso del tempo, la visione integralista dell’EBM è andata scemando ed è chiaro che le evidenze scientifiche non possono prescindere dalla considerazione clinica specifica e dalla sapiente applicazione mediata dall’esperienza (sito della GIMBE). Oggi però è troppo difficile trovare dei libri che vadano oltre le semplici revisioni bibliografiche, tanto che viene da chiedersi che senso abbia un libro in cui i semplici e vituperati pareri di esperti non hanno più posto. Spendere centinaia di euro per una pubblicazione che più o meno ti dice le stesse cose di una ricerca su PubMed ben condotta, non ha molto senso (la stragrande maggioranza degli articoli è disponibile liberamente solo in forma di abstract, ma quasi sempre i concetti di fondo di un articolo sono condensati lì). Quando si compra un libro, lo si fa anche per il nome e la fama dell’autore e ci si aspetterebbe che ci dicesse qualcosa di personale ed utile, magari proprio in relazione all’applicazione pratica delle evidenze scientifiche. Altrimenti si rischia di pagare a peso d’oro qualcosa che dopo pochi mesi è superato. Per non parlare poi delle edizioni italiane di libri scritti in inglese: traduzioni non sempre all’altezza, edizioni tronche e mutilate rispetto all’originale (avete presente il Greene di malattie infettive che da noi è arrivato solo con le malattie batteriche e parassitarie?) e via aberrando.

Ma torniamo all’inizio. Nell’editoriale del numero di aprile 2008 di Compendium – Continuing Education for Veterinarian, Thomas K. Graves fa un’ottima rassegna dei metodi più opportuni per valutare l’attendibilità delle referenze bibliografiche.

Amore alla prima citazione: guida alle referenze bibliografiche per il lettore serio

Prof. Thomas K. Graves

Diversi anni fa, mentre leggevo una review sul trattamento dell’ipertiroidismo felino, trovai una frase, debitamente referenziata, secondo cui il metimazolo causa una disfunzione piastrinica nel gatto. Fui tutto eccitato nel constatare che il problema del sanguinamento nei gatti non trombocitopenici sotto terapia con metimazolo era stato risolto, ma fui anche un po’ deluso perché nel mio laboratorio avevamo lavorato per trovare una risposta a questo problema, ma senza successo. Andai all’ultima pagina dell’articolo, ansioso di controllare il riferimento e, con mia grande sorpresa, scoprii che per quella frase era stata citata una mia pubblicazione (1). In quel riferimento (il capitolo di un libro) avevo affermato che alcuni gatti sotto terapia con metimazolo mostrano problemi di sanguinamento nonostante la piastrinemia normale – affermazione che avevo attentamente referenziato (2) – e che erano in corso degli studi per indagare gli effetti del metimazolo sulla funzione piastrinica. Dopo essermi ripreso, sentendomi colpevole, andai a controllare il capitolo originale per essere sicuro di non avere detto qualcosa d’ingannevole. Nel capitolo avevo suggerito che il metimazolo potesse causare una disfunzione piastrinica, ma chiarendo che erano necessari studi ulteriori (1).

Le imprecisioni nelle citazioni degli articoli delle riviste sono frequenti (3,4), non solo in medicina veterinaria, ma probabilmente in tutti i campi. L’analisi accurata dei riferimenti da parte degli editori e dei revisori può ridurre la frequenza degli errori nelle citazioni (5) ma non li può eliminare del tutto. Controllare il contenuto effettivo di ogni citazione e determinarne la validità come riferimento, rappresenta certamente un lavoro impossibile per uno staff editoriale. Dipende dalla responsabilità degli autori. Questi, essendo umani, spesso non si assumono questa responsabilità, lasciandola al lettore che deve controllare la validità delle affermazioni referenziate. Una lunga lista di citazioni può dare l’impressione che un manoscritto sia stato curato a fondo da parte degli autori, ma non è sempre così. Di contro, una lista breve non deve per forza essere considerata inadeguata, in quanto i riferimenti possono essere di buona qualità ed applicati accuratamente. Ma allora come fa il lettore a sapere se questi numerini possono assicurare il valore di un’affermazione o devono destare sospetti?

Il metodo migliore per stabilire la qualità di un riferimento è leggerlo. Ovviamente questo è impossibile per la maggior parte di noi. Anche se avessi tanto tempo libero, dubito che lo vorrei spendere nel cercare le pubblicazioni originali. Comunque mi assicuro sempre di controllare almeno alcune caratteristiche che mi possano dare un indizio sulla qualità generale delle citazioni di un articolo. Quelle che seguono sono le cose che guardo.

Capitoli di libri. Citare i capitoli dei libri è una pratica frequente nella letteratura biomedica. Lo faccio spesso anch’io nei miei articoli, ma non sempre è giustificato farlo. Per esempio, recentemente ho letto un articolo su una stimata rivista di dermatologia, contenente l’affermazione che l’ipotiroidismo è la più frequente patologia endocrina del cane. Quest’asserzione si trova spesso nella letteratura endocrinologica veterinaria, ed è una delle mie fissazioni. Secondo me l’ipotiroidismo è molto meno frequente di quanto pensi la maggior parte dei veterinari, anche se è di sicuro la malattia endocrina del cane diagnosticata più spesso (non necessariamente correttamente). L’affermazione dell’articolo di dermatologia era supportata dal riferimento ad un capitolo sull’ipotiroidismo in un manuale. In realtà il capitolo non dice nulla del genere: contiene una tabella che mostra che il diabete mellito è la sindrome di deficienza ormonale vista più di frequente nella pratica dell’autore. La citazione nella rivista di dermatologia era chiaramente travisata.
Nello stesso articolo ho trovato un’affermazione secondo cui i pazienti ipotiroidei possono manifestare dermatite batterica ed otite come unici segni. Trovando questa cosa difficile da credere, ho controllato la citazione. Il riferimento era un altro capitolo di un manuale. Sono andato a vedere il capitolo nella sesta edizione del libro, trovando che citava la quinta edizione. La quinta edizione citava la quarta. La quarta citava la terza. Nella terza edizione, la frase su cui m’era sorto il dubbio, era referenziata dai dati dell’autore non pubblicati e da un oscuro articolo – vecchio di 27 anni – di una ricerca sui topi. Ho scovato l’articolo murino ed ho scoperto che non aveva niente a che vedere con l’ipotiroidismo, per cui si è trattato di una citazione sbagliata fin dall’inizio. Questo è chiaramente un caso limite, ma i riferimenti ai capitoli dei libri vanno sempre visti con una certa dose di sospetto, in particolar modo se vengono fatte affermazioni discutibili. I capitoli dei manuali non sono soggetti al vaglio scientifico della peer review (revisione paritaria). Spesso contengono affermazioni largamente basate sul parere di esperti. Come autore di numerosi capitoli, sono certamente colpevole anch’io di questo.

Pubblicazioni peer review non arbitrate. Ci sono diversi livelli di peer review. Il più alto livello di controllo è proprio delle riviste con revisione ufficiale da parte di un comitato di revisione. Queste riviste in genere pubblicano l’elenco dei revisori. Altre riviste si affidano soprattutto agli editori ed ai comitati editoriali, delle volte utilizzando revisori paritari esterni, ma di solito non pubblicano la lista dei revisori. Queste sono dette riviste peer review non arbitrate. Anche se possono essere di qualità molto alta, il livello di controllo non sempre raggiunge l’eccellenza delle riviste arbitrate.

Atti. Le pubblicazioni degli atti di incontri scientifici vengono spesso utilizzate come riferimenti negli articoli. Questa pratica va considerata estremamente sospetta. Gli atti solitamente non sono peer review e neanche revisionati da un editore.

Abstract (riassunti). Gli abstract sono generalmente soggetti ad un qualche livello di revisione scientifica, ma questa non è quasi mai rigorosa come per gli articoli delle riviste arbitrate. Tra l’altro gli abstract talvolta possono essere quasi nascosti in una lista di riferimenti. Consideriamo l’esempio seguente:

Gilor C, Graves TK. Serum fructosamine does not correlate with body weight, body condition score or age in cats. J Vet Intern Med 2007;21:595.

All’occhio non sospettoso questo appare come un articolo di una rivista stimata. Non lo è. È un abstract dall’incontro annuale dell’ACVIM. Non può ricevere lo stesso peso di un articolo regolare. È anche un esempio di abstract non chiaramente identificabile come tale, come invece dovrebbe essere. Inoltre un abstract vecchio probabilmente deve essere considerato un riferimento piuttosto debole perché gli abstract che successivamente non diventano manoscritti regolari possono non essere completamente attendibili.

Riferimenti vecchi. Se un’affermazione è così basilare che un riferimento vecchio di decadi è sufficiente per supportarne la validità, probabilmente non necessita di alcun riferimento. D’altronde i riferimenti vecchi rischiano di essere datati.

Tesi. I riferimenti alle tesi dei master o di laurea talvolta vanno guardati con sospetto. Si suppone che una tesi di laurea sia soggetta alla revisione da parte di una commissione di laurea, ma chiaramente non è la stessa cosa di un processo di peer review anonimo. Se viene citata una vecchia tesi, ci si deve chiedere perché nessuna pubblicazione su riviste arbitrate è scaturita da quel lavoro.

Auto-referenzialità. A volte un autore può essere la sola persona che è solita fare pubblicazioni su un certo argomento, per cui non può fare altro che citare i propri lavori. Un riferimento o due da parte dell’autore principale dell’articolo sono buona cosa. Permettono al lettore di conoscere qualcosa sul background e la competenza dell’autore. Tuttavia troppa auto-referenzialità può essere indice di miopia intellettuale.

Comunicazioni personali. I riferimenti a comunicazioni personali forniscono praticamente il supporto più debole possibile per un’affermazione di un articolo.

Osservazioni non pubblicate. Come le comunicazioni personali, anche i riferimenti alle osservazioni non pubblicate probabilmente non dovrebbero essere usati, a meno che riguardino qualcosa che non influisce sul significato dell’articolo o sull’interpretazione dei dati.

Ogni riferimento fornito può essere perfettamente valido, ma un certo grado di diffidenza è salutare se ci accompagna nella lettura della letteratura scientifica. La maggior parte degli editori delle riviste veterinarie fa un lavoro eccellente nella considerazione dell’accuratezza e dell’appropriatezza dei riferimenti. Sfortunatamente alcuni riferimenti non sono adeguati. È necessario un alto livello di competenza non solo per gli autori, gli editori ed i revisori, ma anche per i lettori. Personalmente penso che sia una buona cosa.

Riferimenti:

1. Graves TK. Complications of treatment and concurrent illness associated with hyperthyroidism in cats. In: Bonagura JD, ed. Kirk’s Current Veterinary Therapy XII. Philadelphia:WB Saunders; 1995:369-372;
2. Peterson ME, Kintzer PP, Hurvitz AI. Methimazole treatment of 262 cats with hyperthyroidism. J Vet InternMed 1988;2:150-157;
3. Hinchcliff KW, Bruce NJ, Powers JD, Kipp ML. Accuracy of references and quotations in veterinary journals. JAVMA 1993;202:397-400;
4. Wager E,Middleton P.Technical editing of research reports in biomedical journals. Cochrane Database Syst Rev 18:MR000002, 2007;
5. Wager E, Middleton P. Effects of technical editing in biomedical journals: a systematic review. JAMA 2002;287:2821-2824;
6. 6. Feldman EC, Nelson RW. Hypothyroidism. In: Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. 3rd ed. St. Louis: Saunders; 2004:86-151.

Personalmente c’è un’altra cosa che controllo sempre ed ancor prima di iniziare a leggere: eventuali conflitti d’interesse, sponsorizzazioni o se tra gli autori ci sono dipendenti di ditte farmaceutiche. Nessuno pensa male a prescindere, ma mi si conceda che, mettiamo, tra due lavori che trattano l’efficacia di un principio attivo per una data patologia, ammesso che siano condotti con gli stessi criteri di rigore scientifico, consideri in maniera diversa i risultati di quello del tutto indipendente rispetto a quello sponsorizzato o con autori dipendenti. Non credo che questi ultimi lavori siano falsi, anzi, sono sicuro che non lo siano. Ma sinceramente non ho ricordanza di aver letto un giudizio, o anche solo l’evidenza (o la sottolineatura) di risultati negativi in questo tipo di articoli. E non dico neppure che vengano omessi completamente eventuali risultati negativi; è sufficiente dare un peso diverso ai risultati positivi ed a quelli negativi, a partire dal titolo per finire alla discussione. Infine sarebbe opportuno anche dare il giusto peso ad una pubblicazione in relazione all’autore o agli autori: di solito se un autore ha già pubblicato decine di lavori su riviste peer review, quello che dice deve essere considerato in un’ottica diversa rispetto ad un autore con poche pubblicazioni alle spalle.

In ogni caso è sempre necessaria un po’ di quella che Graves chiama diffidenza, perché, anche controllando tutto il controllabile, i lavori possono sempre essere imprecisi, sbagliati, incompleti, travisati, pretestuosi o addirittura in malafede. Fortunatamente il controllo non si limita ai comitati editoriali prima della pubblicazione, ma si estende anche alla fase post-pubblicazione e sono i lettori che possono individuare lavori indegni e segnalarli, per esempio, con le lettere alle riviste.

The landscape of canine stifle disease remains relatively unchanged despite decades of research, billions of consumer dollars, and generations of affected dogs… It is time to use the expertise and skills honed from decades of patient care and investigation to cut the fishing line and shift the paradigm of canine CCL disease. The reports featured in this 2-part special issue highlight the creativity, knowledge, and technology being directed to canine CCL disease.

[ Prima parte - Seconda parte ]

Scopo di questo studio è stato di investigare la prevalenza, le manifestazioni cliniche ed i fattori di rischio associati ad insufficienza renale acuta nei pazienti affetti da VL.I soggetti sono stati trattati con iniezioni endovenose di Glucantime^® (AnM, 20 mg/kg/die per 20-40 giorni) e, nei casi gravi, di amfotericina B (AmB, dose totale 7-20 mg/kg fino a 20 giorni); ai pazienti con infezioni secondarie sono stati somministrati antibiotici. Sono stati inclusi 224 soggetti (età 36 ± 15 anni, range 15-84) di cui il 76,8% erano maschi.

L'insufficienza renale acuta (IRA) è stata osservata in 76 pazienti (33,9%) di cui l'85,5% erano maschi e 26 (34,2%) avevano una creatininemia superiore a 1,4 mg/dl al momento dell'accesso in ospedale; 39 soggetti (51,3%) hanno sviluppato IRA entro una media di 10 giorni dall'inizio della terapia con AmB, 7 (9,2%) con AnM e 4 (5,3%) per altre cause. I pazienti in IRA rispetto a quelli non-IRA hanno mostrato livelli superiori di BUN, creatininemia, kaliemia, bilirubinemia diretta ed indiretta e WBC; mentre livelli inferiori di natriemia, bicarbonatemia, pCO₂, albuminemia, piastrinemia e tempo di protrombina. I fattori chiaramente associati ad IRA sono risultati il genere maschile, l'età avanzata, l'ittero e la somministrazione di AmB. Questo farmaco nefrotossico in Brasile è la seconda scelta nei casi di VL. È stata osservata un'associazione significativa tra il suo utilizzo e l'IRA nei pazienti che non avevano risposto all'AnM: l'IRA è stata osservata in 39 soggetti trattati con AmB (l'82,9% dei trattati col farmaco, ovvero il 17,4% di tutti i soggetti). Il 20,9% ha ricevuto AnM e AmB; tutti i pazienti trattati con AmB avevano le creatininemia normale all'ammissione; la somministrazione di AnM è stata associata con una minore incidenza di IRA (AmB: 39 pazienti IRA [51,3%], 8 non-IRA [5,4%]; AnM: 37 IRA [48,7%], 140 non-ira [94,6%]). La mortalità totale è risultata del 13,3% (30 soggetti), significativamente più alta nei pazienti IRA (23 [30,2%]) rispetto ai non-IRA (7 [3,1%]). I fattori di rischio di morte sono risultati la somministrazione di AmB, l'oliguria, l'ittero e la dispnea.

Il coinvolgimento renale nella VL è considerato raro e si presenta con ematuria, proteinuria od alterazioni della funzionalità renale. In letteratura esistono scarse informazioni sull'associazione IRA – VL. Uno studio ha rilevato alterazioni renali in solo 1 paziente su 11 (11%) considerando la creatininemia > 1,4 mg/dl. Il presente studio ha rilevato un'incidenza superiore di IRA (33,9%) nei pazienti con diagnosi di VL accertata. In uno studio recente le alterazioni renali (creatininemia > 1,3 mg/dl) sono state riscontrate nel 26,2% di 57 pazienti con VL. In un altro lavoro è stata riscontrata una diminuzione di GFR nel 28% di 50 soggetti e la causa è stata attribuita alla perdita di liquidi, alla contrazione del volume ed alla patologia glomerulare immunomediata.

HCO₃ e pCO₂ sono risultati inferiori nei pazienti IRA, suggerendo un'alta incidenza di acidosi metabolica probabilmente secondaria alla disfunzione renale. Uno dei dati salienti emersi dallo studio è la forte associazione tra AmB (non liposomiale) ed IRA: i pazienti trattati con AmB hanno un rischio 18 volte superiore di andare in IRA. Questo è emerso anche in altri lavori con percentuali dei pazienti trattati con AmB ed andati incontro ad IRA che oscillano intorno all'80%.

(Risk factors for acute kidney injury in visceral leishmaniasis (Kala-Azar) – Oliveira MJ, Silva Júnior GB, Abreu KL, Rocha NA, Garcia AV, Franco LF, Mota RM, Libório AB, Daher EF – Am J Trop Med Hyg. 2010;82(3):449-53 [abstract])

Il fenotipo morfologico dell’anca di un cane è il risultato combinato degli effetti di un numero imprecisato di fattori genetici e non genetici (“ambientali”). Fattori ambientali, come rapida crescita ed alimentazione eccessiva, sono stati associati con lo sviluppo della DdA, mentre soggetti cresciuti con dieta controllata mostrano risultati della DdA significativamente inferiori, così come un’osteoartrite di minor gravità rispetto ai cani alimentati senza controllo. Le differenze morfologiche delle razze – per quanto riguarda altezza, peso, lunghezza e statura – hanno possibili influenze sul carico dell’articolazione coxo-femorale. Appare dunque logica l’ipotesi che le differenze di conformazione dettate dagli standard di razza possano rappresentare un altro fattore che contribuisce alla predisposizione alle patologie muscolo-scheletriche come la DdA; ed è supportata dall’osservazione che una caratteristica morfologica, l’indice di massa corporea (BMI), dei cani di diverse razze, è significativamente correlato con l’incidenza della DdA. Da qui scaturisce la questione se l’aumento del rapporto peso/altezza possa portare ad una maggiore predisposizione di alcune razze alla DdA. Gli autori hanno ipotizzato che uno di questi fattori, il rapporto lunghezza/altezza del corpo (L/A), possa influenzare l’espressione della DdA in certe razze. La lunghezza relativa del corpo è indirettamente correlata al BMI, dal momento che un cane più lungo ha il potenziale di sopportare un maggior peso in relazione alla sua altezza rispetto ad un soggetto di razza simile ma dalla forma più quadrata. Il ruolo della selezione per le caratteristiche morfologiche apprezzate nelle mostre e dettate dagli standard di razza non è mai stato esaminato a fondo.  Questo studio ha messo in correlazione i risultati pubblicati della patologia dell’anca con le misurazioni del rapporto L/A del corpo ottenute dalle fotografie dei soggetti campioni di 30 razze per stabilire se i criteri di selezione possono compromettere il benessere aumentando la predisposizione alla DdA.

I risultati sono chiari: la lunghezza relativa del corpo è in forte correlazione con gli accresciuti tassi di DdA ottenuti dai dati di razza dell’Orthopedic Foundation for Animals (USA), della BVA (UK) e dell’Australian Veterinary Association (Australia), suggerendo decisamente che le proporzioni delle razze con corpo lungo le possano predisporre alla DdA. Tra l’altro i dati analizzati provengono da programmi volontari, per cui sono a rischio di auto-selezione, essendo improbabile che vengano sottoposti a screening radiografico i soggetti con DdA clinicamente manifesta.

C’è da dire che anche se i risultati dello studio indicano chiaramente l’associazione tra alto rapporto L/A e DdA, questo non può essere generalizzato a tutti i canidi; del resto una tale conformazione (si vedano i Dobermann campioni) non è comune in natura: è vero che la volpe ha un elevato L/A, ma di solito pesa meno di 10 Kg. Relativamente ai paragoni con la morfologia dei canidi selvatici, bisogna tenere a mente una differenza fondamentale: gli animali selvatici sono il prodotto della selezione naturale nei confronti delle funzioni adattative (all’ambiente), mentre la conformazione delle attuali razze canine è stata artificialmente selezionata quasi solo in base a principi estetici. Quando gli allevatori delle razze a corpo lungo delle origini selezionavano per questa conformazione, purtroppo non hanno tenuto nella debita considerazione anche l’anatomia necessaria per sopportare questi cambiamenti.

Nel favorire morfotipi più lunghi che alti, i giudici possono aver selezionato involontariamente attributi conformazionali che predispongono i cani alla DdA; e questo suggerisce che le ambiguità negli standard di razza ed i fenotipi estremi di lunghezza relativa del corpo possono determinare gravi conseguenze per il benessere e debbono essere rivisti drasticamente. E questo per due ragioni fondamentali. In primo luogo: molti standard attuali alludono al fatto che sono desiderabili soggetti più lunghi che alti (per esempio lo standard del Mastino Napoletano dice che i soggetti devono essere il 10-15% più lunghi che alti) ed i giudici delle mostre premiano prontamente l’aspetto rettangolare che è tipico di molte delle razze che oggi sono afflitte dalla DdA, come il Basset Hound ed il Dogue de Bordeaux. In secondo luogo: in tutti e tre i continenti valutati in questo studio, l’ambiguità degli standard di razza sulle proporzioni prescritte, o la totale assenza di informazioni in questo senso, lasciano troppo spazio all’interpretazione da parte dei giudici e degli allevatori, promuovendo la selezione insistita dei morfotipi estremi. La forte correlazione di questa variabile morfologica con la prevalenza della patologia, insieme a tutta una serie di altri disordini ereditari che accompagnano i fenotipi canini estremi, indicano che le descrizioni vaghe e le caratteristiche soggettive mettono a repentaglio la salute ed il benessere del cane. Ricerche ulteriori dovrebbero sostenere lo sviluppo di standard di razza completi, con specifiche linee guida morfologiche orientate alla salute, per aiutare gli allevatori ad ottenere fenotipi più sostenibili ed adattativi. In questo processo è imperativa l’umiltà, perché chi si dedica all’allevamento del cane deve abbracciare l’idea che le morfologie maladattative, che storicamente sono state considerate caratteristiche della razza ideale, devono essere abbandonate, se veramente si vuole che tra le priorità ci siano la salute ed il benessere del cane.

(Selection for breed-specific long-bodied phenotypes is associated with increased expression of canine hip dysplasia – Vet J. 2010;183(3):266-72 [abstract])

Meningite cronica da Leishmania.

Al congresso Gemi-Geo 2010, che si è tenuto lo scorso aprile ad Avignone, sono stati riportati 3 casi di meningite da Leishmania nel cane (comunicazione breve in francese). Sono stati visitati tre soggetti di sesso femminile (Dora, un Épagneul Breton di 1,5 anni e due Border Collie di 5 [Missi] e 9 anni [Vanka]) per problemi neurologici: Dora presentava una sindrome algica recidivante, Missi ipertermia e dolori toraco-addominali e Vanka era in tetraparesi. La citologia del LCS rivelava pleiocitosi corrispondente ad un infiltrato infiammatorio di cellule mononucleate (macrofagi e cellule linfoidi). La PCR sul LCS per cimurro, toxoplasmosi, neosporosi, ehrlichiosi e leishmaniosi, era positiva solo per quest’ultima; mentre la sierologia su sangue era negativa nei due soggetti in cui era stata eseguita. La terapia – prednisolone, AnM ed allopurinolo – permetteva un rapido miglioramento in tutti e tre i pazienti. In uno, la PCR su LCS dopo 8 giorni di terapia (il cortisonico era stato interrotto da 4 giorni), dava risultato negativo e la citologia mostrava una netta diminuzione della cellularità.

Le foglie fresche sono state tritate e riscaldate in acqua distillata al 20% (w/v) per 30' a 50 °C, quindi l'estratto acquoso è stato lipofilizzato e ricostituito con PBS prima dell'uso. Dopo aver infettato i topi per via EV con 10⁷ promastigoti di L. chagasi, sono stati sottoposti al trattamento orale giornaliero (dal giorno 1 al giorno 29 post-infezione) con 400 mg/kg di estratto (Kp). Ai controlli negativi (cn) è stato somministrato il PBS (200 µl) ed a quelli positivi (cp) 72 mg/kg di stibiogluconato di sodio (Pentostam^®) – equivalenti a 20,2 mg di Sb^V/mg/kg – per via intraperitoneale a giorni alterni.

Rispetto ai cn, nei topi trattati con Kb si è registrata una carica parassitaria inferiore nella milza e nel fegato rispettivamente di 4 e 6 volte; con un'efficacia paragonabile al trattamento dei cp. Il giorno 30 post-infezione è stata valutata la produzione di anticorpi specifici (IgG) e delle classiche citochine Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-4): il gruppo test ha fatto registrare una diminuzione significativa di IgG ed IL-4 ma non di IFN-γ (nei cp invece le IgG e l'IFN-γ sono risultati inalterati e l'IL-4 è aumentata). Sia il gruppo test che i cp hanno fatto registrare un aumento di NO rispetto ai cn. La VL è comunemente associata a grave immunodepressione che non solo indebolisce le difese dell'ospite contro la malattia, ma anche la risposta al trattamento con gli antimoniali. Per questo, per trattare questa patologia, c'è urgente bisogno di sviluppare nuovi farmaci che rinforzino le risposte immunitarie e che rendano l'ospite più attivo nel killing dei parassiti intracellulari. Questo studio dimostra che l'attività osservata in precedenza di Kp nella CL è applicabile anche alla VL, utilizzando il modello murino dell'infezione, indicando l'ampio spettro nelle leishmaniosi. Anche se si tratta di un estratto grezzo dalla composizione definita solo in parte, la conoscenza crescente dell'effetto soppressivo Th2, l'attività anti-Leishmania dei componenti flavonoidi e la bassa tossicità, supportano ulteriori sviluppi dell'estratto come nuovo trattamento orale ed a basso costo per il trattamento della leishmaniosi.

(Effectiveness of the immunomodulatory extract of Kalanchoe pinnata against murine visceral leishmaniasis – Gomes DC, Muzitano MF, Costa SS, Rossi-Bergmann B – Parasitology. 2010 Apr;137(4):613-8 [abstract]).