Leishmune: il vaccino brasiliano

Vaccino Leishmune^®: Il nuovo mezzo per la prevenzione ed il controllo della leishmaniosi viscerale canina ed il suo potenziale come vaccino che blocca la trasmissione

Filipe Dantas-Torres (Leishmune^® vaccine: the newest tool for prevention and control of canine visceral leishmaniosis and its potential as a transmission-blocking vaccine – Vet Parasitol. 2006 Oct 10;141(1-2):1-8. Epub 2006 Jun 5 [abstract]).

1. Introduzione

[...] La leishmaniosi viscerale zoonosica è la forma più grave di leishmaniosi ed è spesso mortale se non curata (1). Le misure di controllo più spesso impiegate contro questa zoonosi sono la diagnosi e la terapia precoci dei casi umani, insieme all’uso di spray insetticidi in ambiente domestico. Benché la soppressione dei cani sieropositivi venga ancora praticata in alcuni Paesi, soprattutto in Brasile (2), essa non può essere universalmente accettabile per ragioni etiche (3) e per il suo impatto modesto in situazioni di trasmissione permanente (4). Inoltre la soppressione dei cani sieropositivi è ritenuta meno efficace di altre strategie come il controllo del vettore e la vaccinazione canina (5, 6).

2. Prevenzione della leishmaniosi viscerale canina

Uno dei metodi più efficaci per la prevenzione della leishmaniosi viscerale canina è evitare il contatto tra il cane ed i flebotomi. Questo non è semplice. Per esempio in Brasile Lutzomyia longipalpis (il principale vettore di L. infantum) è altamente adattato agli ambienti domestici e peri-domestici e si nutre su diversi animali selvatici e domestici, soprattutto cani (7, 8). Dunque come si possono proteggere i cani dalle punture dei flebotomi?
Negli ultimi 10 anni è stato dimostrato che l’uso di collari impregnati d’insetticida è un mezzo efficace di prevenzione delle punture dei flebotomi (9 – 14). Questi collari agiscono sia in senso di repellenza che di uccisione nei confronti dei flebotomi che tentano di nutrirsi sui cani. Studi condotti in Brasile e Francia, tramite flebotomi allevati in laboratorio, hanno rilevato che collari impregnati di deltametrina proteggono i cani da circa il 96% delle punture fino a 34 settimane (9, 11). Studi di campo hanno dimostrato che l’uso di massa dei collari impregnati d’insetticida sui cani può ridurre l’incidenza della leishmaniosi canina nelle aree d’intervento (10, 13, 14). In teoria i flebotomi possono ricercare fonti di sangue alternative (per es., l’uomo) quando respinti dai cani. Ma al contrario di quanto ci si aspetterebbe dalla teoria, in Iran è stato dimostrato che l’applicazione estensiva dei collari riduce il rischio d’infezione nei bambini (13). Questo suggerisce che i collari impregnati d’insetticida possono essere utili per il controllo della leishmaniosi canina con un effetto positivo anche sul controllo della malattia nell’uomo. Benché l’impatto dell’uso dei collari impregnati d’insetticida sia superiore rispetto alla soppressione dei cani sieropositivi (13, 14), l’efficacia di questa misura profilattica dipende anche da altri fattori, come la copertura dei collari (cioè la percentuale di cani che indossano il collare in una data popolazione) ed il tasso di perdita (14).

Lo sviluppo di un vaccino efficace contro la leishmaniosi, è stato il fine di molti studi negli anni più recenti. [...] I candidati per un vaccino canino vanno da forme vive di Leishmania (vaccini di prima generazione) a batteri vivi ricombinanti che esprimono antigeni di Leishmania e DNA plasmidi codificanti-antigeni (vaccini di seconda generazione). A fronte di tutti gli sforzi [riferimenti bibliografici omessi] ed i progressi [rrbboo], non esiste un vaccino contro la leishmaniosi umana e, fino all’epoca più recente, canina [rrbboo].

3. Leishmune^®: il primo vaccino contro la leishmaniosi viscerale canina

Dopo 25 anni di ricerche, un vaccino contro la leishmaniosi viscerale canina è stato autorizzato dal Ministero dell’Agricoltura Brasiliano [...]. Il vaccino Leishmune^® è prodotto dalla Fort Dodge Animal Health™ ed è il primo vaccino al mondo contro la leishmaniosi viscerale canina.
Il vaccino Leishmune^® consiste di una frazione purificata isolata da L. donovani più un adiuvante alla saponina. La frazione purificata, detta fucose mannose ligand (FML), è un complesso glicoproteico che inibisce molto attivamente in vitro l’infezione dei macrofagi di topo da promastigoti ed amastigoti di L. donovani [rrbboo]. L’FML, presente sulla superficie di L. donovani durante tutto il suo ciclo biologico [rrbboo], è un potente immunogeno nel coniglio e nel topo [rrbboo ]. Inoltre è un antigene specifico sensibile e predittivo nella diagnosi sierologica della leishmaniosi viscerale umana [rbo] e canina [rbo]. [...]
Modelli sperimentali nel topo [rrbboo] e trial di fase III [rrbboo] indicano che il vaccino Leishmune^® è un’opzione promettente per la prevenzione della leishmaniosi viscerale canina in Brasile. Inoltre recentemente è stato evidenziato il suo potenziale come dispositivo che blocca la trasmissione [rrbboo], suggerendo la sua utilità nel controllo della leishmaniosi viscerale zoonosica.

4. Modelli sperimentali nel topo

La vaccinazione con FML più saponina ha indotto una riduzione considerevole della carica parassitaria nel fegato di topi femmina BALB/c [rbo]. Un altro studio simile eseguito tramite topi Swiss Albino ha rivelato che l’FML più saponina induce la produzione di anticorpi, soprattutto del sottotipo IgG2a, e riduce la carica parassitaria senza effetti collaterali (15).
[...]

5. Trial di fase III: la conferma dei modelli nel topo

Sono stati eseguiti due trial di fase III nel municipio di São Gonçalo do Amarante (Stato di Rio Grande do Norte), dove la leishmaniosi viscerale zonnosica è endemica. C’è da dire che il primo trial di fase III (16) ha presentato alcuni problemi metodologici, in quanto non è stato né randomizzato né cieco. Il secondo trial (17) invece, è stato ben progettato, randomizzato, con cieco e controllato, e da questo è possibile trarre diverse conclusioni. In entrambi i trial i cani del gruppo-intervento hanno ricevuto 3 dosi sottocutanee di vaccino a 21 giorni d’intervallo, mentre quelli del gruppo-controllo sono stati trattati con una singola iniezione di soluzione fisiologica sterile. Nel primo trial di fase III, dopo 2 anni di sperimentazione, l’8% dei cani vaccinati ha mostrato moderati segni clinici di leishmaniosi viscerale e nessun caso di morte. In contrasto, il 33% dei controlli ha sviluppato una forma di malattia clinicamente manifesta o mortale (16). Nel secondo trial, dopo 3,5 anni di studio, il 5% dei cani vaccinati ed il 25% dei controlli ha sviluppato una forma di malattia clinicamente manifesta o mortale (17).
In entrambi i trial tutti i cani vaccinati hanno mostrato una reazione positiva alla leishmanina (DTH, con lisato di L. donovani) in un periodo di 2 mesi (16) o 7 mesi (17) post-vaccinazione. Il test di DTH (ipersensibilità di tipo ritardato), detto anche test cutaneo di Montenegro o alla leishmanina (LST), è un mezzo utile per la valutazione dell’immunità cellulo-mediata nell’infezione da Leishmania sia nell’uomo [rbo] che nel cane [rrbboo]. Dal momento che la resistenza naturale all’infezione da L. è principalmente di tipo T-cellulo-mediato [con intervento precipuo dei linfociti T, ndw] (18), l’LST è stato usato come indice d’immunità protettiva. Al contrario di quanto accade nei cani con leishmaniosi attiva, la maggior parte dei cani naturalmente infetti asintomatici sono LST positivi [rrbboo]. Ci si potrebbe chiedere se la risposta immunitaria protettiva documentata nei trial di fase III, sia stata indotta in parte dall’LST invece che dal vaccino FML. Anche se è vero che una singola applicazione di leishmanina può indurre una risposta immunitaria cellulo-mediata Leishmania-specifica (19), è improbabile che protegga il cane dall’infezione da L. (20).
Come atteso per un vaccino alla saponina (21), sono stati rilevati anticorpi anti-FML nel 97% dei cani vaccinati nel primo trial (16), e nel 100% nel secondo (17). E’ comunque importante rimarcare che gli anticorpi anti-L. non riflettono lo stato di protezione (22) e addirittura possono indicare uno stato di suscettibilità in assenza di risposta positiva proliferativa delle cellule T (23).
I trial di fase III hanno indicato che il vaccino FML induce un effetto protettivo significativo nel cane, con un’efficacia fino all’80% (17). Tali risultati confermano quanto evidenziato nei modelli sperimentali nel topo [rrbboo].

6. Vaccino FML come agente immunoterapeutico

Nel topo un modello di trattamento immunoterapeutico col vaccino FML-saponina contro la leishmaniosi viscerale ha prodotto risultati promettenti. Topi BALB/c vaccinati hanno mostrato aumenti specifici di anticorpi IgG1, IgG2a e IgG2b, risposte all’LST, [...] e diminuzione dei livelli di IL-10 (24). Inoltre solo nei soggetti vaccinati è stata notata una diminuzione della carica parassitaria nel fegato.
Tali risultati, unitamente alla considerazione del relativo fallimento della chemioterapia contro la leishmaniosi viscerale canina, hanno incoraggiato la ricerca dell’efficacia del vaccino FML nell’immunoterapia della stessa (25). 5 cani meticci sono stati infettati per via endovenosa con 108 amastigoti di L. donovani e poi vaccinati al giorno 127, 164 e 187 con FML più saponina QuilA. Inoltre 21 cani asintomatici, FML-sieropositivi, provenienti da un’area endemica per leishmaniosi canina, hanno ricevuto 3 dosi di vaccino FML più saponina R. Dopo 22 mesi d’osservazione non s’è registrato alcun caso di morte dovuto alla leishmaniosi nei cani vaccinati, ed il 90% di questi era ancora asintomatico, in salute e parassitologicamente sterile. In contrasto, nello stesso periodo, sono morti 17 su 46 cani del gruppo-controllo (25).
Basandosi su questi risultati, sarebbe possibile concludere che il vaccino FML sia in grado di prevenire lo sviluppo della leishmaniosi viscerale canina anche nei cani già infetti. Ma anche se il vaccino Leishmune^® può essere un’opzione per l’immunoterapia della leishmaniosi viscerale canina, attualmente non ci sono prove attendibili che possano spingerne l’uso come agente immunoterapeutico. Ed in accordo col produttore, questo vaccino è raccomandato unicamente per i cani asintomatici e sieronegativi.

7. Leishmune^® come vaccino che blocca la trasmissione

Il primo trial di fase III del vaccino FML ebbe inizio nel dicembre 1996 ed i cani vennero seguiti per 24 mesi. Per coincidenza o no, l’incidenza dei casi umani di leishmaniosi viscerale zoonosica in São Gonçalo do Amarante diminuì da 15 casi nel 1996 a 0 fino al maggio 1998 (16). La domanda sorge spontanea: il vaccino FML può avere un qualche effetto sull’incidenza dei casi umani di leishmaniosi viscerale zoonosica? E nel caso, questo avverrebbe per la riduzione dell’infettività della popolazione canina o bloccando la trasmissione nei flebotomi femmina o per entrambi i fattori? Per cercare di rispondere a queste domande, è stato indagato il potenziale del vaccino nel bloccare la trasmissione (26): 11 mesi dopo la vaccinazione, tutti i cani vaccinati erano positivi per gli anticorpi anti-FML. Inoltre i cani vaccinati risultavano negativi alla PCR e senza segni clinici di leishmaniosi. In contrasto, il 25% dei controlli manifestava segni clinici, il 56,7% era positivo alla PCR su linfonodo, il 15,7% a quella su sangue ed il 25% mostrava reazioni immunoistochimiche positive. I risultati di questo studio, in particolare l’assenza di parassiti nella cute dei cani vaccinati, indicano che il vaccino Leishmune^® può bloccare la trasmissione di L. infantum tra i cani vaccinati e dunque può contribuire al controllo della leishmaniosi viscerale canina.

I vaccini che bloccano la trasmissione rappresentano il fine definitivo nel controllo di certi parassiti digenetici. Per esempio, i vaccini che bloccano la trasmissione della malaria inducono la formazione di anticorpi contro gli antigeni dello stadio sessuato, bloccando lo sviluppo dello stadio infettivo di Plasmodium (sporozoite) nella zanzara femmina [rbo]. Recentemente è stata testata la capacità del vaccino Leishmune^® di inibire il legame di promastigoti prociclici di L. donovani e L. chagasi (=L. infantum) con intestini medi dissezionati di L. longipalpis (27): il tasso e la velocità d’infezione sono risultati significativamente più alti nei flebotomi che avevano ricevuto un pasto di 1,5 x 10⁷ amastigoti rispetto al sangue umano ed al siero di cani non vaccinati. I risultati di questo studio molto interessante dimostrano chiaramente che Leishmune^® è un potenziale vaccino che blocca la trasmissione, aprendo una nuova prospettiva per il controllo della leishmaniosi viscerale canina. Inoltre, se davvero gli anticorpi dei cani vaccinati con Leishmune^® prevengono lo sviluppo dei promastigoti metaciclici nei flebotomi femmina, questo vaccino sicuramente avrà un qualche impatto nella trasmissione della leishmaniosi viscerale zoonosica.

8. Sono necessarie ulteriori ricerche

Il vaccino Leishmune^® ha offerto la prospettiva di una nuova era nella prevenzione e nel controllo della leishmaniosi viscerale canina e conseguentemente della leishmaniosi viscerale zoonosica. Comunque c’è ancora da rispondere a molte domande in studi futuri. Sono necessarie ulteriori prove di campo col vaccino Leishmune^®. Questi studi andrebbero eseguiti in altri municipi. Studi caso-controllo potrebbero essere utili per rispondere ad alcune domande e per stimare l’efficacia del vaccino. Per esempio, è importante conoscere i possibili fattori di rischio della leishmaniosi viscerale nei cani vaccinati.
Occorre anche un profilo più dettagliato della risposta immunitaria che si sviluppa in seguito alla vaccinazione. Quali sono le conseguenze degli effetti di questo vaccino sull’equilibrio Th1/Th2? Le cellule mononucleate del sangue periferico dei cani vaccinati producono più interferone-gamma di quelle dei cani non vaccinati? Questo migliorerà le conoscenze attuali sulle modalità con cui questo vaccino induce una risposta immunitaria protettiva in certi cani (e non in altri), ed inoltre fornirà utili spunti nel campo dei vaccini della leishmaniosi.

Il costo iniziale del programma vaccinale (3 dosi a 21 giorni d’intervallo) con Leishmune^® è di circa 100 $ per animale. Sfortunatamente la maggior parte dei proprietari di cani, che vive in aree rurali e suburbane povere del Brasile, non se li può permettere. Quindi è importante valutare il rapporto costo/beneficio del programma vaccinale canino, non solo nella prevenzione dei singoli casi, ma anche nel controllo della leishmaniosi canina nella prospettiva della comunità. Certamente questa strategia potrebbe sostituire la controversa soppressione dei cani sieropositivi e potrebbe contribuire efficacemente al controllo della leishmaniosi viscerale zoonosica, riducendo la proporzione di cani infettanti o bloccando la trasmissione vettoriale o entrambi. Per ridurre i costi, la vaccinazione dei cani contro la leishmaniosi viscerale potrebbe coincidere con le campagne di vaccinazione anti-rabbia (2).

Allo stato attuale non c’è nessun test sierologico che distingua gli anticorpi indotti dal vaccino da quelli che si formano in seguito all’infezione naturale da L. infantum, anche se la sottoclasse delle IgG1 sarebbe associata all’infezione naturale e quella delle IgG2 alla risposta umorale indotta dal vaccino FML (28). Indubbiamente si tratta di un aspetto che va sviluppato in ulteriori studi. Un test in grado di differenziare i cani vaccinati da quelli con infezione naturale, in ambito di sanità pubblica, aiuterebbe a prendere la decisione di sopprimere o no un dato cane sieropositivo.
La condizione non infettante per i cani vaccinati col vaccino FML è stata suggerita dalla normale proporzione tra linfociti T CD4 e CD21 nel sangue di questi animali (25). Ciò nonostante la condizione non infettante dei cani vaccinati deve essere confermata dalla xenodiagnosi (23), con lo scopo di rafforzare l’utilità di questo vaccino come mezzo di controllo della leishmaniosi viscerale zoonosica.

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