7. Diagnosi

Nelle aree endemiche per leishmaniosi canina, i test sierologici devono far parte dello screening di routine, ed ogni cane malato deve essere considerato potenzialmente infetto fino a prova contraria.

A. Blavier, S. Keroack, P. Denerolle, I. Goy-Thollot, L. Chabanne, J.L. Cadoré, G. Bourdoiseau

Approfondimento: limiti diagnostici della sierologia (articolo di Jacques Lamothe).

In zone dove la leishmaniosi ha un’ampia diffusione, spesso si ha la tendenza ad etichettare un cane solo sulla base dei sintomi clinici, magari con qualche dato di laboratorio aspecifico. Ovviamente è fondamentale non fermarsi ad una valutazione del genere, ma procedere onde addivenire ad una diagnosi con metodo specifico; altrimenti si corre il rischio di non diagnosticare più del 50% dei casi realmente infetti (Gradoni, 2002).

7.1. Diagnosi differenziale

Molti dei segni clinici rilevabili in corso di leishmaniosi, sono comuni anche ad altre patologie, altrettanto comuni nelle zone endemiche, che possono essere concomitanti con la leishmaniosi stessa. Questo fatto, oltre a complicare la diagnosi, rende ancor più difficoltosa l’applicazione di un protocollo razionale per ciò che concerne la terapia (già di per sé aspetto piuttosto delicato). La tabella che segue può essere utile in ambito diagnostico differenziale.

Diagnosi differenziale della leishmaniosi canina (Ciaramella, De Luna, 1999)
Malattia Decorso Quadro clinico Rilievi di laboratorio
EPATOZOONOSI Subacuto – cronico Esposizione alle zecche; diarrea, anoressia, scolo nasale ed oculare, paraparesi, dimagrimento, osteoalgia e mialgia, febbre, talora linfoadenomegalia Neutrofilia, monicitosi, gametociti nei neutrofili e nelle fibrocellule muscolari, ipergammaglobulinemia, modica anemia
RICKETZIOSI Acuto – cronico Esposizione alle zecche; febbre 39,5 – 40 °C, anoressia, profonda depressione, mialgia e artralgia, congiuntivite, deficit vestibolari, linfoadenomegalia, aritmie, dispnea, edemi Leucocitosi, monocitosi, anemia normocromica normocitica, trombocitopenia; aumento di ALT, AST, GGT, BUN; test sierologici specifici (IFAT > 1/128)
EHRLICHIOSI Acuto – cronico Esposizione alle zecche, febbre superiore a 40 °C, depressione, anoressia, mucose pallide, tendenza al sanguinamento, splenomegalia, linfoadenomegalia, uveite, segni neurologici Marcata pancitopenia; aumento di ALT, AST, ALP; ipergammaglobulinemia, test sierologici specifici (IFAT > 1/100)
BABESIOSI Iperacuto – acuto – cronico Esposizione alle zecche, depressione, febbre, anoressia, mucose pallide, itteriche, splenomegalia, petecchie, emoglobinuria, DIC. Portatori cronici Anemia rigenerativa, test di Coombs positivo, bilirubina aumentata, presenza dei parassiti nei globuli rossi, test sierologici specifici (IFAT > 1/140)
LINFOMA Subacuto – cronico Linfoadenomegalia sistemica o regionale, dimagrimento, mucose pallide, splenomegalia, epatomegalia, diarrea Presenza di cellule linfomatose nel puntato linfonodale, midollare e/o sangue circolante; aumento di ALT, AST, ALP, bilirubina, BUN e calcio; anemia normocromica normocitica
DERMATITE ALLERGICA ALIMENTARE Cronico Prurito non stagionale, eritema diffuso coinvolgente l’addome, il dorso, la testa e la regione perianale, cui fa seguito alopecia, lichenificazione ed iperpigmentazione, otite esterna Possibile eosinofilia e positività ai test intradermici; test dietetico
DERMATITE ALLERGICA DA MORSO DI PULCI Cronico Esposizione alle pulci, prurito stagionale, eritema diffuso, talvolta crostoso localizzato alle regioni inguinali, perineali, dorso – lombari e agli arti posteriori. Pelo spezzato Presenza di pulci o di detriti (feci); test intradermici
DERMATITE ATOPICA Cronico Alopecia periorbitale, prurito, leccamento delle estremità delle zampe, crisi di starnuti, lacrimazione, otite esterna, adenite perianale Test intradermico
DEMODICOSI Subacuto – cronico Animali giovani o immunodefedati (l’affezione può essere concomitante alla leishmaniosi, per l’immunodeficienza che l’accompagna); eritema perioculare o follicolite diffusa pustolosa, in genere non pruriginosa; pododermatite Presenza di Demodex canis al raschiato cutaneo [foto di un cane con demodicosi]
ROGNA SARCOPTICA Subacuto – cronico Animali giovani o immunodefedati; lesioni (papule e croste) inguinali, ascellari, margini dei padiglioni auricolari o diffuse, in genere pruriginose. Contagiosità Presenza di Sarcoptes scabiei al raschiato cutaneo

7.2. Esami di laboratorio

Gli esami di laboratorio sono di fondamentale importanza al fine di emettere correttamente la diagnosi, ma anche a fini prognostici e come monitoraggio durante la terapia. Classificazione degli esami di laboratorio:

  • Esami specifici:
    • Parassitologici (previa biopsia linfonodale, cutanea, del midollo osseo, della milza, ecc.) (tecniche dirette):
      • Strisci di materiale opportunamente colorato onde evidenziare gli amastigoti;
      • Esami colturali (isolamento delle leishmanie: promastigoti);
      • Xenodiagnosi (rilevazione della Leishmania negli insetti vettori);
    • Sierologici (tecniche indirette):
      • IFAT (IFI);
      • ELISA;
      • Dot ELISA;
      • IHAT (emoagglutinazione indiretta);
      • CIEP (controimmunoelettroforesi);
      • Fissazione del Complemento;
      • Test all’inchiostro di china;
    • PCR (reazione a catena della polimerasi, diagnostica molecolare);
    • Prove biologiche;
  • Esami aspecifici:
    • Protidemia totale e frazionata (protidogramma), elettroforesi delle proteine sieriche;
    • Formol-gelificazione;
    • Esame emocromocitometrico;
    • BUN e creatininemia;
    • Enzimi epatospecifici (ALT, AST, ALP);
    • VES;
    • Esame delle urine;
    • Test di immunologia clinica (soprattutto per i fenomeni autoimmuni: latex test, test di Coombs e ANA-test).

Gli esami specifici sono quelli più importanti, in quanto consentono di ottenere la diagnosi di leishmaniosi in maniera diretta o indiretta. Invece gli esami aspecifici hanno l’utilità di segnalare al diagnosta una qualche forma di sofferenza d’organo o di apparato che possa essere – direttamente o indirettamente – correlata con la leishmaniosi. Inoltre le indagini diagnostiche aspecifiche sopra elencate, hanno l’indubbia utilità di permettere controlli nel tempo, consentendo una duplice informazione: valutazione delle condizioni generali del paziente in senso dinamico ed apprezzamento della risposta alla terapia. Da quest’ultimo punto di vista, al contrario, gli esami specifici assumono una minor rilevanza, per lo meno nel breve periodo, in quanto difficilmente, nel cane, è possibile ottenere una negativizzazione parassitologica, a prescindere dalla bontà (in senso lato) della terapia. È da rimarcare come non ci sia accordo fra i dati riportati dai diversi Autori, per quanto riguarda la sensibilità e la specificità dei metodi diagnostici specifici. Le maggiori discordanze dell’efficacia relativa dei diversi tool diagnostici, si verificano soprattutto allorché vengono considerati gli studi (campioni) trasversali (cross-sectional samples), molto frequenti nella pratica veterinaria, invece degli studi longitudinali, come quelli caso-controllo (case-control studies) (Gradoni, 2002).

7.2.1. Esame parassitologico

Questo tipo di esame diagnostico andrebbe sempre preso in considerazione, soprattutto al cospetto di pazienti sintomatologicamente sospetti (oligosintomatici) con IFI dubbia o negativa, come anche in seguito a terapia e negativizzazione dell’esame sierologico. Gli strisci di materiale bioptico (linfonodale, midollare, splenico, epatico, ecc.) possono essere colorati col metodo di Giemsa (preceduto dalla fissazione di May-Grünwald o con metanolo) che permette un’agevole evidenziazione degli amastigoti. È doveroso aggiungere però che non sempre l’esame microscopico è risolutivo. Nelle frequenti paucinfezioni infatti il numero di protozoi risulta scarso; in generale un campione dovrebbe essere considerato negativo quando vengano esaminati 1000 campi con obiettivo 100X senza alcun riscontro parassitologico. Ciò evidenzia che tale esame, pur altamente specifico, è relativamente sensibile, e quindi di scarsa utilità nelle ricerche di massa, con un numero di campioni da esaminare elevato (Mancianti, 2001). La rilevazione di amastigoti nel sangue periferico, pur possibile, è molto rara (a meno di non utilizzare particolari tecniche di concentrazione), sia nell’uomo che nel cane. Quando questa è possibile, si tratta in genere di fasi precoci d’infezione, anche se è stato segnalato il ritrovamento di un numero notevole di amastigoti nel sangue circolante di un cane in un periodo diverso da quello di piena infettività (Foglia Manzillo et al., 2005).

7.2.2. IFI

  • Esame semplice e rapido, anche se presenta lo svantaggio di richiedere infrastrutture operative specifiche (università pubbliche, laboratori privati);
  • Tecnica sicura, in quanto dotata di specificità (semplificando, un esame con specificità del 100% è quel test che evidenzia solo ed esclusivamente quel dato parametro e non altri che possono avere delle analogie con esso) e sensibilità (semplificando, un esame altamente sensibile è quel test che evidenzia anche quote infinitesime di quel dato parametro) elevate, pur potendosi riscontrare un 5-6% di falsi negativi (Bizzeti et al., 1989). È altresì segnalata una sensibilità fra il 98,4 ed il 99% (Mancianti, 2001) (semplificando, i falsi negativi sono quei risultati negativi per un errore insito nella tecnica, per un difetto di sensibilità [nel senso suddetto] del test stesso);
    • Viene riportata una specificità del 100% per titoli anticorpali superiori a 1/160, valore che attualmente viene accettato da esperti italiani e francesi come titolo soglia per diagnosticare un’infezione da Leishmania (Mancianti, 2001).In passato è stato anche fatto riferimento ad un sospetto in caso di titolo 1/40 e ad una pressoché certa positività in caso di titolo 1/80 (Bizzeti et al., 1989).Si può quindi affermare che un riscontro sierologico positivo a titolo superiore o uguale a 1/160 indica sempre infezione in atto; mentre titoli compresi fra 1/40 e 1/80, in assenza di sintomi, devono essere considerati dubbi (controlli bimestrali); inoltre si può avere malattia anche con sierologia negativa (Mancianti, 2001);
    • Secondo Mancianti (2001) gli animali asintomatici ma con titolo elevato (uguale o superiore a 1/160) andrebbero comunque sottoposti a terapia, sia per evitare o comunque ritardare un’eventuale fase clinica della patologia, sia a scopo profilattico per evitare, se così si può dire, lo stato di portatore asintomatico, cioè di serbatoio d’infezione per gli altri animali e per l’uomo.Secondo Oliva (2002), invece, le tendenze recenti indicherebbero di sottoporre a terapia specifica solo gli animali nei quali sia dimostrabile il parassita (isolamento, osservazione microscopica, ecc.); e questo almeno per titoli anticorpali IFAT uguali o superiori a 1/80 – 1/160, anche se in presenza di segni clinici di malattia (nessuno dei quali patognomonico);
  • La metodica utilizza come antigeni promastigoti di Leishmania fissati su vetrino:
    • Diluizione del siero in esame per raddoppio in base 10;
    • Incubazione con l’antigene per 30 minuti a 37°C;
    • Lavaggio;
    • Aggiunta di un’antiglobulina specifica coniugata con isotiocianato di fluorescina;
    • Incubazione a 37°C;
    • Lavaggi;
    • Montaggio dei vetrini con glicerina;
    • Osservazione dei vetrini con microscopio a raggi ultravioletti;
    • I sieri positivi conferiscono una netta fluorescenza ai promastigoti ed al flagello;
  • Si tratta di un esame che dipende piuttosto strettamente dall’interpretazione personale dell’esaminatore, per cui dovrebbe essere effettuato sempre presso lo stesso laboratorio e, nei casi dubbi, solitamente di fronte a titoli bassi, è consigliabile la ripetizione magari a distanza di 20 – 30 giorni.Sempre in relazione a titoli dubbi, necessita di un ulteriore supporto diagnostico attraverso la ricerca dei parassiti nei linfonodi o nel midollo osseo (esame parassitologico) (Bizzeti et al., 1989).

I risultati positivi dei test sierologici indicano soltanto un’infezione, la quale non necessariamente coincide con uno stato di malattia (differenza fra infezione e malattia infettiva). Del resto non è detto che alla puntura di un vettore infetto succeda uno stato di infezione persistente; forse questa si realizza solo in conseguenza di diversi contatti tra il parassita e l’ospite (Mancianti, 2001). In generale una tecnica sierologica attendibile (com’è l’IFAT), rileva con maggiore precisione gli anticorpi negli stadi avanzati dell’infezione, sia negli animali sintomatici sia in quelli asintomatici; ma non si deve dimenticare che esistono diversi casi che possono andare incontro a sieroconversione da positivi a negativi, nel corso dell’infezione stessa.

Si consiglia la lettura dell’articolo di Jacques Lamothe, sui limiti della sierologia nella diagnosi della leishmaniosi canina.

7.2.3. PCR

Si tratta di un metodo in vitro per la sintesi di una sequenza specifica di DNA; si usa per identificare piccole quote di DNA specifico (oligonucleotide) di un organismo, in diversi campioni, attraverso un’amplificazione logaritmica. Nella diagnosi della leishmaniosi canina la PCR può essere eseguita su sangue intero, midollo osseo, linfonodo o altri tessuti bioptici. Un metodo innovativo, non invasivo, è risultato quello che consiste nel prelievo, tramite tampone di cotone sterile per batteriologia, di materiale esfoliativo congiuntivale (congiuntiva palpebrale); questo metodo è risultato sensibile (92%), soprattutto se il prelievo viene effettuato da entrambi gli occhi, e specifico (100%) (Strauss-Ayali et al., 2004 [HTMLPDF]). Partendo dalla considerazione che i cani leishmaniotici hanno notevoli cariche parassitarie a livello cutaneo a prescindere dalla presenza di lesioni specifiche, anche la PCR su campioni bioptici cutanei del padiglione auricolare ha dato buoni risultati di sensibilità e specificità (Xavier et al., 2006 [HTMLPDF]). Possono essere utilizzati primers (sequenze specifiche di oligonucleotidi che reagiscono col materiale genomico in questione) universali di Leishmania oppure specie-specifici (questi ultimi permettono di evidenziare la specie esatta di Leishmania). La tecnica risulta più sensibile dell’osservazione diretta (strisci e colture) e della sierologia, nella diagnosi sia di leishmaniosi canina che umana. La tecnica è utile anche durante e dopo il trattamento, per cui può contribuire all’eventuale scelta della sospensione della terapia (Roura, 2001). Certamente anche la PCR non è scevra da limiti: non permette di differenziare un parassita “vivo” da uno “morto” (perché può rilevare la presenza di DNA parassitario non vitale, con la possibilità di risultati falsamente positivi) e richiede un personale più che qualificato, al fine di evitare le contaminazioni crociate, sia durante i prelievi sia al laboratorio (col rischio di falsi positivi) (Guetta, 2000). Xavier e coll. (2006, cit.) raccomandano cautela nell’interpretazione dei risultati della PCR perché la positività non necessariamente corrisponde alla presenza di parassiti vivi nei tessuti. In genere questa tecnica rileva, in maniera più attendibile e con maggior precisione, gli stadi precoci della malattia, e quindi anche i casi transitori ed autolimitanti, cioè quei cani che in qualche modo risolvono l’infezione (Gradoni, 2002).

7.2.4. Protidogramma (elettroforesi delle proteine sieriche [Bizzeti, 1998])

Distribuzione delle proteine del plasma sul tracciato elettroforetico (Figura 1)

Tracciato elettroforetico normale Fig. 1 – Tracciato normale in soggetto sano.
Tracciato elettroforetico: aumento delle beta e gamma globuline Fig. 2 – Aumento policlonale delle globuline beta e gamma (infezione recente).
Tracciato elettroforetico: aumento delle beta e gamma globuline Fig. 3 – Aumento policlonale delle globuline beta e gamma (aspetto a pan di zucchero).
Tracciato elettroforetico: ipoalbuminemia, aumento delle beta e gamma globuline Fig. 4 – Ipoalbuminemia, aumento policlonale delle globuline beta e gamma (infezione di vecchia data).
Tracciato elettroforetico: infezione di vecchia data Fig. 5 – Tendenza del picco betagamma oligoclonale a trasformarsi in monoclonale (infezione di vecchia data).
Tracciato elettroforetico: aumento delle alfa 2 globuline Fig. 6 – Aumento delle alfa2 – globuline (ricaduta, riacutizzazione).
Tracciato elettroforetico: infezione vecchia tendente alla riacutizzazione Fig. 7 – Picco oligoclonale betagamma con un iniziale aumento delle globuline alfa2 (infezione di vecchia data con tendenza alla riacutizzazione).
Tracciato elettroforetico: infezione di vecchia data Fig. 8 – Ipoalbuminemia e picco oligoclonale delle beta e gamma (aspetto ad orecchie di gatto; infezione di vecchia data).
Tracciato elettroforetico: infezione molto vecchia Fig. 9 – Marcata ipoalbuminemia e picco monooclonale delle gamma (infezione molto vecchia).

Oltre all’albumina (la parte all’estrema sinistra del tracciato) si annoverano:

  • alfa1-globuline:
    • alfa1-antichimotripsina;
    • alfa1-antitripsina;
    • alfa1-lipoproteina;
    • proteina C reattiva;
    • sieroamiloide A;
    • orosomucoide;
  • alfa2-globuline:
    • alfa2-macroglobulina;
    • aptoglobina;
    • ceruloplasmina;
    • pre-beta-lipoproteina;
  • beta1-globuline:
    • transferrina;
    • emopessina;
    • beta-lipoproteina;
  • beta2-globuline:
    • fattore C3;
    • eventuale migrazione delle IgM e IgA;
  • gammaglobuline:
    • IgG;
    • IgM;
    • IgA;
    • eventualmente IgE.

Questo esame fa parte dell’insieme dei rilievi della misurazione quantitativa e qualitativa della protidemia; gli altri sono il dosaggio della protidemia totale (PT) ed il rapporto albumina / globuline (A/G).

Di solito la PT risulta aumentata, ma in alcuni casi può essere normale o solo leggermente innalzata; questo può dipendere dal fatto che l’elevazione delle globuline beta e gamma è accompagnata, a volte, dalla diminuzione dell’albumina. Nei casi disprotidemici il rapporto A/G è sempre inferiore a 0,60. Tale disprotidemia è essenzialmente dovuta ad una diminuzione dell’albumina, ad un aumento delle globuline beta e gamma e talvolta delle globuline alfa2.

L’innalzamento delle globuline beta è conseguenza della migrazione in questa banda elettroforetica di alcune immunoglobuline (IgM, IgA), del fattore C3 del complemento, del fibrinogeno e della transferrina. La presenza di tali sostanze in eccesso denota una reazione flogistica in atto e, per quanto concerne la transferrina, l’esistenza di una carenza marziale conseguente ad emolisi autoimmune o alla flogosi stessa. La fusione delle globuline beta e gamma in un picco policlonale indica una produzione eterogenea di immunoglobuline aspecifiche (figg. 2 e 3).

In presenza di riacutizzazioni della malattia, o di forme acute di processi flogistici concomitanti, può essere presente un innalzamento delle globuline alfa2, banda elettroforetica in cui migrano le così dette proteine della fase acuta della flogosi (aptoglobina, alfa2-macroglobulina, ceruloplasmina): un alto picco delle alfa2-globuline può anche conseguire ad un interessamento renale. La persistenza dell’iper-alfa2-globulinemia dopo trattamento, o la sua ricomparsa in caso di recidive, testimonia l’esistenza di una guarigione clinica spiccatamente instabile (figg. 6 e 7).

Un’iper-gamma-globulinemia con picco monoclonale a banda stretta, tipica delle forme più avanzate e di vecchia data, si ha per abnorme sviluppo di un singolo clone anticorpale immaturo (IgG). Questo fatto potrebbe anche avere il significato che esiste un clone maligno e che il processo morboso potrebbe evolvere verso una neoplasia. L’aumento delle globuline gamma è a carico delle IgM e soprattutto delle IgG, che però non risultano efficaci dal punto di vista immunoprotettivo. Quando la rilevazione della protidemia indica un’ipoalbuminemia, soprattutto con PT superiori a 7 g/dl (od a 8), ed un aumento delle globuline beta e gamma, si deve stabilire un forte sospetto di leishmaniosi (Bizzeti et al., 1989).

Ci sono dei quadri elettroforetici che possono apparire analoghi a quelli riscontrati in corso di leishmaniosi (anche se l’aspetto clinico ed altri parametri di laboratorio sono diversi). Similitudini si possono osservare in corso di piometra, ma soprattutto nelle piodermiti profonde del Pastore Tedesco (in cui può insospettire l’aumento delle globuline beta e gamma, anche se tale incremento interessa più che altro la frazione beta1, mentre nella leishmaniosi la beta2).

Valori normali della protidemia nel cane
Parametro Valore assoluto (Buonaccorsi, 1995) Valore percentuale (%) (Bizzeti et al., 1989)
PT 5,4 – 7,1 g/dl (100)
Rapporto A/G 1 – 1,5
Albumina 2,2 – 3,2 g/dl 50 – 60
Globuline alfa1 0,3 – 0,8 g/dl 2 – 4,5
Globuline alfa2 0,5 – 1,2 g/dl 2 – 4,10
Globuline beta 0,7 – 1,6 g/dl 10 – 22,5
Globuline gamma 0,4 – 1 g/dl 8 – 15

Tre delle proteine della fase acuta sopra menzionate – aptoglobina, proteina C – reattiva e ceruloplasmina – si sono rivelate piuttosto utili nella diagnosi della malattia e della relativa fase, con interesse quindi anche prognostico. I livelli di tutte e tre risultano significativamente più alti nei cani positivi rispetto a quelli non infetti; inoltre la concentrazione della proteina C-reattiva è significativamente più alta nei cani sintomatici rispetto a quelli asintomatici. Questi dati, indubbiamente utili, non debbono però essere sopravalutati (così come in generale la fruibilità della sieroelettroforesi), in quanto esistono diverse altre condizioni che possono determinare un incremento dei livelli delle proteine della fase acuta (rischio di false positività): le concentrazioni di aptoglobina e ceruloplasmina sono aumentate in caso, per esempio, di traumi chirurgici e di poliartriti, così come la proteina C – reattiva aumenta nella leptospirosi, nella tripanosomiasi, nelle enteriti batteriche ed emorragiche, nella parvovirosi, nell’ehrlichiosi ed in seguito ad interventi chirurgici. Tutte e tre le proteine, inoltre, possono subire incrementi anche durante i trattamenti corticosteroidei (Martìnez-Subiela et al., 2002).

7.2.5. Test rapidi ambulatoriali

Risultato negativo

Fig. 10 – Test SpeedLeish® negativo.

Risultato positivo

Fig. 11 – Test SpeedLeish® positivo (la banda netta è stata aggiunta in fotoritocco, ma rappresenta benissimo un analogo risultato reale).

Risultato dubbio

Fig. 12 – Test SpeedLeish® dubbio (modificata come la fig. precedente).

In commercio ne esistono diversi. Generalmente si basano sul principio sierologico della rilevazione degli anticorpi anti – Leishmania. Ultimamente è andato affermandosi il principio dell’immunomigrazione. Questi test si prestano per una diagnosi sierologica direttamente in ambulatorio in quanto non necessitano di particolari attrezzature né di personale particolarmente addestrato. Il test SpeedLeish® è risultato di buona affidabilità, associata alla facilità e rapidità di esecuzione, caratteristiche che lo rendono utile nella pratica ambulatoriale, anche se i risultati ottenuti vanno confermati attraverso metodiche diagnostiche più rigorose presso laboratori specializzati (come IFI o PCR). Paragonando i risultati dell’immunomigrazione con quelli dell’IFI, è stata ottenuta una sensibilità del 93% ed una specificità del 97% (semplificando, il test risulta fornire risultati falsamente positivi in misura pressoché trascurabile, mentre sono più probabili i risultati falsamente negativi; semplificando ed approssimando, la possibilità che un risultato positivo corrisponda ad un “mancato contatto” col parassita è piuttosto bassa).

Rivò e collaboratori hanno considerato i risultati dubbi (fig. 12) come risultati negativi, al pari di quelli chiaramente negativi (fig. 10). Le risposte dubbie necessiterebbero di ulteriori approfondimenti da parte del produttore del test perché possono creare dubbi a operatori poco esperti. Tali situazioni si verificano prevalentemente su soggetti risultati poi negativi all’IFI. Queste risposte dubbie potrebbero essere dovute a reazioni crociate per altri agenti eziologici, fenomeno che, come asserito dal produttore stesso, sarebbe comune su sieri provenienti da zone dove la leishmaniosi è endemica (Rivò et al., 2000). Nonostante l’accennata indubbia utilità di simili test, appare chiaramente evidente che, di fronte a risultati nettamente negativi o dubbi, non è facile decidere come procedere ulteriormente nell’accertamento diagnostico; mentre un approfondimento ulteriore è pressoché scontato di fronte a risultati di positività. Del resto può essere utilizzato esclusivamente un test rapido ambulatoriale, con sufficiente sicurezza, per il controllo periodico dei cani che vivono in zone endemiche? O può essere sufficiente una semplice elettroforesi delle proteine sieriche? O entrambi?

7.2.6. Il problema della comprensione Th1/Th2 (Miranda et al., 2007)

Sulla base di quanto asserito nella pagina della patogenesi (paragrafo 3.2.1.1 – Il paradigma in dubbio) – i soggetti infetti con malattia clinicamente manifesta mostrano una risposta immunitaria prevalentemente umorale e non protettiva (simil-Th2), mentre i soggetti infetti che non sviluppano la malattia mostrano una risposta immunitaria prevalentemente cellulare e protettiva (simil-Th1) (Ferrer et al., 2000) – nella pratica clinica, sarebbe molto utile disporre di tecniche semplici, veloci e di basso costo, che permettano di determinare l’intensità della risposta immunitaria cellulare nei cani leishmaniotici, al fine di stabilire la prognosi e di valutare la risposta alla terapia. Il test cutaneo alla leishmanina (LST) è certamente il metodo più facilmente applicabile in condizioni pratiche, anche se la necessità del follow-up a 72 ore dall’inoculo, la variabilità intrinseca comune ad ogni test in vivo e la possibilità di indurre falsi positivi iatrogeni in seguito a test ripetuti, ne minano la fruibilità (Fernández-Bellon et al., 2005). Una tecnica alternativa può essere la determinazione della variazione delle diverse sottopopolazioni linfocitarie ematiche in corso di terapia: ci sono diverse pubblicazioni sull’utilizzo in questo senso della citometria di flusso (Fc). In base a queste, risulta che nei cani malati si assiste ad una riduzione della percentuale dei linfociti T CD4+ e del rapporto CD4/CD8+, che si normalizzano in seguito alla terapia ed alla guarigione clinica (Bourdoiseau et al., 1997; Moreno et al., 1999; Guarga et al., 2000, 2002). Molti di questi studi, però, sono stati condotti su un numero di casi esiguo e con follow-up brevi o assenti. Partendo dal presupposto ipotetico che la percentuale delle cellule CD4+ ed il rapporto CD4/CD8+ possano essere buoni indicatori dell’evoluzione della malattia e del relativo stato immunologico, Miranda e coll. hanno condotto uno studio volto a stabilire il numero di diverse sottopopolazioni di LT circolanti (CD3+, CD4+, CD8+ e CD21+) in cani infetti, estendendo il follow-up ad 1 anno, col fine di confermare se i predetti rilievi possano costituire buoni marker della gravità della malattia ed in corso di terapia (antimoniato di meglumina + allopurinolo). Sono stati inclusi nello studio 28 cani di vari razza, sesso ed età già diagnosticati positivi (ELISA, diagnosi parassitologica), senza alcun grado d’insufficienza renale (per l’importanza che rimanessero in vita per tutto l’anno di monitoraggio), sottoponendoli preventivamente a LST; i risultati dell’ELISA e di LST sono serviti per dividere i soggetti affetti in 2 gruppi: 17 cani “affetti moderatamente“, am (ELISA e LST positivi) e 11 cani “affetti gravemente“, ag (ELISA positivo, LST negativo), includendo infine anche 9 cani sani sieronegativi come controllo (c). I 28 cani affetti hanno ricevuto 30 giorni di terapia a base di Glucantime® (100 mg/kg SID) e Zyloric® (10 mg/kg BID). Ad 1 anno dal trattamento nessun cane è deceduto come conseguenza diretta o indiretta della leishmaniosi e tutti i soggetti ag, che inizialmente erano LST negativi, sono risultati LST positivi (cambiamento della risposta immunitaria cellulare). Non è stata rilevata alcuna differenza significativa delle percentuali delle sottopopolazioni di LT, né del rapporto CD4/CD8+ in tutti i controlli (al giorno 0 e poi al 1°, 6° e 12° mese) in tutti e tre i gruppi (am, ag e c). Gli autori affermano che le discrepanze dei risultati di questo studio con quelli degli altri precedentemente citati, possono essere spiegate in diversi modi: per quanto riguarda la valutazione dei LT CD4+ al giorno della diagnosi, gli autori che hanno rilevato una diminuzione di questa sottopopolazione (Moreno et al., 1999 [cit.]; Guarga et al., 2002 [cit]), hanno studiato un numero di animali molto più basso, ed altri hanno incluso una popolazione di animali molto eterogenea ed alcuni soggetti erano in una fase della malattia decisamente avanzata. Anche nel presente studio è stata rilevata una certa diminuzione dei CD4+, in particolare nel sottogruppo ag, benché senza sufficiente significatività statistica. In riferimento al follow-up dell’evoluzione della percentuale di queste cellule, i risultati non sono facilmente comparabili con quelli delle due precedenti pubblicazioni citate – in cui veniva rilevato un aumento dei CD4+ in risposta alla terapia – sempre per il numero esiguo di animali di detti lavori; ma anche in questa prospettiva (follow-up dei CD4+ in risposta alla terapia nel sottogruppo ag) un aumento significativo di queste cellule si è verificato pure nel presente studio, anche se non nell’intero gruppo dei cani malati. È importante notare che i valori normali delle sottopopolazioni linfocitarie nel sangue circolante, mostrano delle marcate variabilità individuali, e questo può spiegare i risultati contraddittori ottenuti da diversi gruppi di ricerca: mentre nel presente caso nessun cambiamento significativo è stato osservato nella sottopopolazione dei LT CD21+ nei cani malati, alcuni autori hanno rilevato un loro aumento (Moreno et al., 1999 [cit.]) ed altri una loro diminuzione (Boudoiseau et al., 1997 [cit.]). Inoltre, come nel presente studio, anche Rosypal e coll. (2005) non hanno rilevato variazioni delle percentuali dei CD4+ e CD8+ in cani sperimentalmente infetti con lo stipite nord-americano di L. infantum. In conclusione gli autori affermano che:

  • Non ci sono differenze significative nelle sottopopolazioni di LT tra cani sani e leishmaniotici;
  • Non c’è una chiara correlazione tra la risposta alla terapia e le percentuali di queste sottopopolazioni;
  • Tali percentuali non possono essere utilizzate come parametri per predire l’evoluzione clinica del paziente;
  • Dal momento che la risposta immunologica alla L. dipende dalla componente cellulare del sistema immunitario, e che nella specie canina è stato dimostrato che gli animali infetti che non sviluppano la malattia o che rispondono bene al trattamento, presentano una risposta immune eminentemente cellulare, l’indicatore di prima scelta per lo studio dell’evoluzione della malattia e dello stato immunologico individuale, molto probabilmente è rappresentato dal profilo delle citochine espresse dalle cellule mononucleate del sangue periferico (linfociti e monociti), in particolare IL-4, IFN-gamma e IL-2.

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Ultima modifica: 19 febbraio 2015 @ 10:21 36''
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